Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo básico para a rotulagem fluorescentes de diferentes elementos de tubos de coração de larva e adulto
Abstract
O
Protocol
Antes de começar a
- Prepare as seguintes soluções:
- buffer de relaxamento (artificial Drosophila hemolinfa (ADH) (ver "Visualizando o coração batendo em Drosophila") que contém 10 mM EGTA)
- fixador (formaldeído 4% em PBS 1x)
- PBSTx (PBS contendo 0,1% Triton-X-100)
- Apropriadamente diluída primário e espécie-específicos fluorescente etiquetado anticorpos secundários em PBSTx
- Dissecar Drosophila para expor os tubos cardíacos (de moscas e / ou larvas), após
- o semi-intactas Drosophila protocolo de preparação do coração em "Visualizar o coração batendo em Drosophila", ou
- Drosophila larval Dissection MNJ um protocolo com as seguintes modificações: Use oxigenado ADH durante a dissecção larval e deslocar o pino posterior ligeiramente da linha média ventral. As larvas são cortados ao longo da linha média ventral. Não remova qualquer tecido antes da fixação.
A coloração fluorescente
- Verifique se todos os corações estão batendo ritmicamente na ADH oxigenado. Substituir rapidamente ADH relaxante com buffer. Examine cada tubo cardíaca para assegurar contrações são inibidas.
- Corrigir os corações, substituindo o buffer relaxante com fixador. Incubar à temperatura ambiente por 20 minutos, agitando suavemente. (Para agitar a preparação larval não é necessário em qualquer etapa, e pode ser considerada prejudicial à integridade do tecido cardíaco).
- Lavar as amostras três vezes por dez minutos com PBSTx em temperatura ambiente com agitação contínua.
- Para os adultos, apare cuidadosamente de volta as bordas ventral da cutícula abdominal tal que o que resta é mais elíptico e menos arredondadas. Além disso, com um único corte entre o abdômen e tórax, com cuidado e limpa separar segmentos de corpo e garantir o mínimo dano à região anterior do coração. Para corações larval, remova cuidadosamente a gordura corporal usando uma pinça fina. A remoção de gordura deve ser executada com extrema cautela, pois o coração larval é muito frágil e tem muito pouco apoio de outros músculos ou tecido conjuntivo. Não remova os ramos traqueais, pois isso pode danificar o coração.
- Transferência da região dorsal aparados da cutícula abdominal pelas bordas, evitando contato com o tubo de uma localização central cardíaca, em uma placa de 96 poços de bem com que contêm 5-10 mL de anticorpo primário diluído em PBSTx. Coloque no máximo 12 amostras por poço. Incubar à temperatura ambiente por 2 horas com agitação contínua. Incubação pode ser feito também durante a noite a 4 ° C.
- Remoção da solução de anticorpo primário. Lavar os corações de três vezes por dez minutos com 100 mL PBSTx em temperatura ambiente com agitação contínua.
- Após a remoção do tampão de lavagem final, adicionar 100 ul do anticorpo secundário em PBSTx, suplementado com Alexa594-phalloidin (1:1000). Incubar durante uma hora com agitação contínua à temperatura ambiente. Manter as amostras coberta para evitar fluoróforo branqueamento.
- Após a incubação secundário, lave os corações de três vezes por dez minutos com 100 ul de PBSTx em temperatura ambiente com agitação contínua. Mantenha as amostras cobertas durante todas as etapas de lavagem.
- Para a remoção de 100-Triton-X, lavar os corações pela última vez em 100 ul de PBS por 10 minutos. As amostras podem ser armazenadas no escuro a 4 ° C por vários dias antes da montagem.
Corações de montagem para Adultos
- Aderir dois 18 x 18 mm a lamínulas uma lâmina de microscópio com 10 ml de Vectashield meio de montagem. As lamelas devem ser espaçadas ~ 10-15 mm. Coloque uma pequena gota terço do meio de montagem em entre as duas lamelas.
- Coloque 20 l de Vectashield no centro de uma lamela terceiros.
- Remova cuidadosamente cada um dos corações da solução de lavagem PBS pelas bordas extremas da cutícula, e colocá-los suavemente coração voltada para baixo sobre a queda de meio de montagem da lamínula terceiros. Lugar não mais de cinco corações por gota na lamela.
- Verificar sob um microscópio para garantir que todos os corações estão voltados para baixo.
- Cuidadosamente inverter a lamela contendo os corações e rapidamente colocá-lo no slide que contém o par de lamelas de tal forma que a gota com fusíveis cardíaca tubos com a gota Vectashield entre o par lamela. A "ponte" deve ser formado por as lamelas. Os corações serão suspensas entre uma lamela ea lâmina de microscópio.
- Verificar sob um microscópio para assegurar que os corações estão agora viradas para cima.
- Fix lamínulas em suas bordas com unha polonês.
- O coração agora está pronto para ser trabalhada por meio de microscopia fluorescente ou confocal.
- Colocar uma gota (~ mL 20) Vectashield numa lâmina de microscópio.
- Cuidado de transferência de até dois espécimes larval na Vectashield e orientar lado deles dorsal para baixo, usando agulhas de tungstênio.
- Individualmente arrastar os espécimes para fora do meio de montagem e alinhar cada em paralelo.
- Coloque uma lamela em lados opostos da amostra. Utilizando uma pinça, coloque uma lamela terceiro em cima, colocando primeiro um lado sobre a lamela posterior e baixando-o para a lamela anterior formando uma ponte. Forças capilares fará com que um fluxo de Vectashield de posterior para anterior, que ajuda o alinhamento adequado do coração larval.
- Corrigir todas as lamínulas no lugar, em suas bordas, com unha polonês e cuidadosamente preencher o espaço entre as lamelas com 20-30 mL Vectashield.
- Seal com unha polonês e armazenar a 4 ° C, ou para armazenamento de longo prazo a -20 ° C.
Resultados representante
Quando executado corretamente, todos os componentes e tecidos associados do vaso dorsal deve permanecer intacta e ser facilmente visualizado. A fluorescência de fundo deve ser mínima. Para os adultos, as manchas ventrais camada muscular longitudinal muito bem e produz um sinal significativo (Figura 1 e Figura 2). Os cardiomiócitos subjacente circular no entanto, tendem a não produzir como um sinal intenso que o da camada sobrejacente ventral. Os miócitos da "câmara cônica" anterior do coração adulto contém uma quantidade substancial de material contrátil e, conseqüentemente, a região aparece como o parente mais robusta para o restante do tubo cardíaco. O coração larval mostra um arranjo miofibrilar espiral semelhante à dos cardiomiócitos adultos contráteis (Figura 3).
Figura 1: Top. A micrografia fluorescentes mostrando todo o tubo cardíaco de um adulto Drosophila melanogaster que expressa miosina-GFP. A imagem foi obtida com um microscópio Zeiss Z1 Imager fluorescentes equipado com um módulo ApoTome deslizante. Miosina-GFP é mostrado em verde, actina está manchado com AlexaFluor ® 594 phalloidin (vermelho) e α-actinina é rotulado com anti-α-actinina anticorpos (azul). Observe o procedimento preparativa permita a cobrança de amostras de coração com estruturas bem preservadas. CC = cônica câmara; AM = muscular Alary; V = interna da válvula; VLL = camada muscular longitudinal ventral. Inferior. A região do tubo cardíaco de adultos do CC através do segmento 3 abdominal do coração logo abaixo da camada ventral longitudinal mostrando o arranjo espiral miofibrila contrátil dos cardiomiócitos. Por favor, clique aqui para uma versão maior da Figura 1a, e aqui para uma versão ampliada da figura 1b
Figura 2: Representante pilhas confocal de uma porção anterior do coração adulto corados com AlexaFluor ® 594 phalloidin (vermelho) e um anti-Pericardin (colágeno tipo IV) (verde) do anticorpo. Pericardin está associada com o coração ao longo da superfície ventral, provavelmente provenientes do miofibrilas sentido longitudinal da camada muscular ventral. Por favor, clique aqui para uma versão ampliada da figura 2.
Figura 3: A micrografia fluorescentes do segmento A7 do coração próprio de um estágio larva Drosophila três. A imagem foi obtida com um microscópio Zeiss Z1 Imager fluorescentes equipado com um módulo ApoTome deslizante. Actina é rotulado com AlexaFluor ® 594 phalloidin (verde) e α-actinina está manchado com anti-α-actinina anticorpos (vermelho). Por favor, clique aqui para uma versão ampliada da figura 3.
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Discussion
Aqui apresentamos um protocolo útil para preparar e coloração da Drosophila melanogaster vaso dorsal e dos tecidos adjacentes para geração de imagens através de microscopia fluorescente ou confocal. Nós fornecemos um relato conciso dos passos refinado por e comumente empregado em nosso laboratório para a coloração eficaz que permite a bem-resolvido em imagens in situ de larvas e tubos coração adulto Drosophila. Outros descreveram métodos similares de forma abreviada 2, 3, 4.
Importantes detalhes adicionais requerem consideração aquando da implementação do procedimento de coloração. Por exemplo, como se encontra com outros materiais biológicos, o bastante compatível Drosophila fibras musculares cardíacas tornaram-se bastante frágil fixação seguintes. De nota particular são os múltiplos pares de fibras de suporte Alary anexado ao tubo cardíaco, que são consideravelmente delicado 5, 6, 7. Assim, limitando manipulação desnecessária diminui o estresse físico e dano direto ao tecido fixado e aumenta a probabilidade de visualização de estruturas bem preservadas e completamente intacta. Além disso, a manipulação das amostras de adultos somente nas bordas extremas da cutícula minimiza as chances de perturbação do tecido.
Também é essencial observar que as etapas deste protocolo deve ser considerado simplesmente como um ponto de partida para a imunocoloração bem-sucedida de larva e adulto Drosophila corações. A metodologia é reduzido para o número mínimo de passos necessários para os reagentes comumente utilizados em nosso laboratório. Como acontece com qualquer protocolo de imuno-histoquímica, certos anticorpos podem requerer condições diferentes (bloqueio, quantidades variáveis de detergente, prolongada etapas de lavagem, etc.) Este protocolo pode ser empiricamente optimizada para tais anticorpos para atender às necessidades coloração única de potencialmente qualquer estrutura cardíaca Drosophila.
Estudar o coração usando as técnicas descritas aqui é particularmente poderosa desde Drosophila melanogaster é um sistema modelo altamente tratável, que beneficia de uma grande variedade de bem desenvolvido ferramentas genéticas. Estas ferramentas permitem poder de investigação sem precedentes para estudar a estrutura, desenvolvimento e função do músculo cardíaco e seus componentes. Por exemplo, análise mutacional de proteínas citoarquitetural no coração ajudou a identificar uma variedade de modelos cardiomiopatia em Drosophila 8, 9. Marcação fluorescente dos componentes do sarcômero destes modelos revelou que a dilatação cardíaca em moscas é acompanhado por miofibrilar desorganização e perda de material contrátil. Além disso, vários GFP-inserção linhas estão disponíveis 10. O protocolo acima pode ser usado em combinação com tais linhas para reunir informações morfológicas detalhadas sobre a localização e as potenciais interações moleculares feita por proteínas GFP. Além disso, as coleções do genoma RNAi de linhas de fly existem 11 que permitem knockdown seletiva de constituintes de proteínas dentro do coração 12. Nosso protocolo de coloração, seguido por microscopia adequado, em conjunto com o knockdown cardíacas específicas de genes de interesse, permitem uma análise cuidadosa da contribuição de uma proteína de estrutura e função do coração. Juntas, essas técnicas fazem um método de triagem poderosa para ajudar a visualizar e decifrar a relevância de uma série de conhecidos, ou previamente descaracterizados, componentes das proteínas necessárias para a morfologia cardíaca adequada e fisiologia.
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Acknowledgments
Os autores agradecem SI Bernstein (San Diego State University) para a leitura crítica e sugestões úteis sobre a preparação deste manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede a SI Bernstein, SDSU, e de R. Bodmer, BIMR, e por uma bolsa de pós-doutorado da filial dos Estados do Oeste da Associação Americana do Coração para G. Vogler e A. Cammarato.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
References
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
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