Summary
技术所需的可视化的幼虫和成虫在跳动的心脏
Abstract
“
Protocol
在您开始之前
成人心
- 刚准备人工血淋巴（AH）的解决方案包含108MM娜5mm的K +，2mm的钙2 +，8MM氯化镁2，1MM的NaH 2 PO 4，4MM碳酸氢钠3，10mm的蔗糖，5mm的海藻糖，5MM的HEPES（pH值7.1，所有的试剂从西格玛化学品）。蔗糖和海藻糖应添加到AH冷藏库存解决方案在使用前，为了防止细菌污染。
- 带来AH室温至少15分钟的含氧空气鼓泡解决方案。
- 拉几个细的毛细血管（如玻璃毛细管，100ul，VWR）去除脂肪。
幼虫的心
- Sylgard涂层的盖玻片：使用牙签，转移到22x22mm盖玻片约50 -70μlSylgard解决方案。在65℃过夜，让Sylgard变硬。
- 准备Broadie和巴特的缓冲区（135mm的氯化钠，氯化钾5MM，4MM MgCl 2的 ，2MM 氯化钙 ，5mm的工商业污水附加费，36mm的蔗糖，pH值7.15 Broadie和巴特，1993年）。
- 准备申请histoacryl胶所需的工具。首先，拉几个细的毛细血管（例如科学产品GB100T8P）。用小塑料管（聚乙烯，1 / 32“），由较小的一端插入管连接一个1.5毫升枪头。一个具有广泛开放的另一端插入毛细管。 Histoacryl胶的胶水和温和的吸力下降到塑料尖的毛细管浸入负载毛细管。胶工作时，手头应该有第二个玻璃毛细管，以消除过度胶胶水毛细管的尖端。胶水液体，直到它接触到的缓冲液，几秒钟内它就会变硬。但是，它通常仍然是塑料的，足够长的时间从胶水毛细管尖或同时应用到的标本中删除。
从成人飞半完整的果蝇心脏
- 成年果蝇苍蝇飞2-5分钟的小睡（北卡罗来纳州生物供应公司）麻醉。必须小心，不要离开苍蝇在飞午睡长时间曝光。短期受寒也可以用于麻醉苍蝇，但CO 2是不推荐，因为它已不再对心率和节律性的持久的影响。
- 麻醉苍蝇被放在背侧下来，到涂有一层薄薄的凡士林培养皿中。可逆的翅膀和身体的疏水角质层“棒”的果冻，但如果需要的话，可以重新定位的飞。这在随后的操作就显得尤为重要。
- 最初的削减是用弯曲的弹簧剪刀对（Roboz＃5611）。剪刀的刀片放在腿下，向附近的颈部胸部背侧表面角度。单一切割头，腹神经索，腿被删除。然后淹没在一个含氧，人工血淋巴（AH）的解决方案的准备工作。
- 使用弹簧剪刀腹部（包括7和第8腹节）后提示删除与单一的削减。这提供了访问沿着腹部的两个边缘的横向削减和供应切断后肠道和腹部角质层之间的连接。腹腹部角质层中解脱出来的皮瓣，然后删除。
- 在步骤3和4对肠道的前部和后部的连接被切断，使腹部器官，现在只由tracheols地方举行。肠道和其他腹部器官，通常可以作为一个单一的大规模使用珠宝商的镊子（Roboz，＃55）和温柔揪着删除。卸下内部器官，揭示仍然附着在背的角质层是由脂肪组织包围着心脏的跳动管。
- 脂肪组织在光镜下相当不透明的，因此它往往是必要去除一些脂肪，以清楚地看到心管。这是通过使用一个吸脂精心绘制的玻璃毛细管技术。毛细血管是使用标准的吸管拉马（如萨特的P - 97移液器拖轮），然后插入塑料管连接到真空源（聚乙烯，1 / 16“）。这个系统是用来关闭多余的脂肪吸从心管周围。吸力尖端直径成正比，所以不应使用提示直径超过40微米的移液器。必须格外小心避免触及心脏本身，因为后部的心是很脆弱的，该地区应完全避免。
- 现在暴露在成年果蝇心管应跳动。如果有必要，可以重新定位的角质层和附加的心轻轻提起凡士林的角质层，并仔细捣固它背下来，又避免与心脏组织有任何接触。在t他的观点洗澡准备的解决方案，应更换新鲜的AHL。应该允许这种准备与充氧20-30分钟达到平衡之前，任何操作。如果准备工作是要维持的时间超过60分钟，应该灌注新鲜的AHL。
固定化果蝇幼虫光学记录
- Sylgard盖玻片的每个角落放置一个Histoacryl胶水下降。胶滴加入B＆B的缓冲液50μL，就会变硬即刻。填写的B＆B粘点之间的空间 - 胶水将保持在幻灯片上的缓冲区。
- 流浪L3幼虫放在一块冰浴2分钟的湿纸巾。这将减缓其运动。然后转移到缓冲区和东方背侧（这是缺乏的锯齿皮带的幼虫侧）的幼虫。快速应用一些胶水之间的头部区域和Sylgard。胶水会变硬非常迅速，防止幼虫的头部移动。
- 使用镊子小心抢后气孔动物，轻轻地舒展。沿幼虫双方申请在后半部的胶固定在这个位置上的幼虫。为了减少进一步的运动由体壁肌肉的角质层，动物的侧面添加更多的胶水。幼虫现在是固定在这个位置上。盖玻片放入一个小的Petri菜充满AHL或PBS。心跳，现在可以记录，不受体壁运动的干扰。
代表性的成果：
几个小时半完整的成年果蝇心脏搏动以下清扫时，在保持新鲜，含氧啊（见补充资料，Ocorr，等，2007）。一个代表性的例子是在影片1所示。 第三龄幼虫和年轻的苍蝇（1 - 3周后羽化）心中普遍表现出心脏跳动在定期利率介于1 - 3赫兹。苍蝇比3个星期一般都比较心律失常以上;然而，这些心中仍然能够击败自发地在含氧的AHL小时。在解剖过程的结果损坏的成蝇的心中通常出现极度收缩的局部地区，都不能放松。心跳率超过1 Hz的慢，很少看到苍蝇超过3周的年龄年轻，因此这类制剂被认为是破坏和被丢弃。
点击这里下载电影1 -一个星期岁成年野生型飞（W 1118实验室应变），显示裸露的腹部心管（前左） 。请注意定期，节律性收缩。在右上角的不透明区域是剩余的腹部脂肪组织;心两侧的圆形细胞是心包的细胞。
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Discussion
果蝇模型已被证明是一个强大的遗传工具，已经被用来解决各种科学问题，从胚胎发育，学习和记忆不等。最近这种多功能的模式生物用于研究在果蝇心脏功能的基因。一些试图量化在成年果蝇的心脏生理依赖于完整的苍蝇经腹角质层的意见。这些方法大多依靠肉眼观察或改变录音，通过腹部的量化一个参数，心率在光照强度变送器。这些方法有一些限制：通常只有心前结束，可以观察到，我们正在观察的是继发的心脏收缩脂肪组织的运动，及神经输入的心是完整的。成人半完整的准备，提供了一个允许量化的参数除了心率正常的心脏很大一部分更详细的视图。它可用于电或光学（见朱庇特的文章，1435）录音程序。此外，该制剂是适合组织学操作（见朱庇特的文章，1435）。它也可以作为一个相对干净的心脏组织样品进行PCR的提取，Western杂交，基因芯片分析等
在果蝇的成人心脏，剥离的目的是，方便地固定在腹部alary肌肉网络的背角质层。因此，它是可能的解剖了的头和腹卧神经索，然后删除不损害心脏的五脏六腑。然而，格外小心，应在第3步，只削减腹部的很尖心延伸到腹段5 / 6和一个起搏细胞或细胞在这一地区无疑是目前。
还必须采取避免触及心脏在解剖。如果怀疑与心脏接触的准备应该被丢弃。中度吸通常足以消除一些环绕心脏心管更好的显示效果，但过度吸脂肪和tracheols也可损害心脏。吸力控制，主要用于吸脂吸头的大小;比约40微米的提示，应避免。
与成人不同，在果蝇幼虫的心管体腔相对自由走动。因此，一个半完整的幼虫心准备光学记录技术的困难。由于半透明的包膜，这是可能的，以可视化的完整的使用明显微镜的幼虫的心。这里所描述的胶技术无法移动任何发育阶段的幼虫，并保持在一个固定位置的心脏。这允许一个相对静止的心管的记录。心脏收缩记录等固定幼虫可随后在朱庇特1435的光学记录技术分析。
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Acknowledgments
Ko是支持由美国心脏协会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
