Summary
기술은 애벌레와 어른의 뛰는 심장을 시각화에 필요한
Abstract
Protocol
당신이 시작하기 전에
성인 심장
- 갓 인공 hemolymph (AH) 108mM 나를 포함하는 솔루션 +, 5mM K +, 2mM 칼슘 2 +, 필름 MgCl 2, 1mM 아니 2 PO 4, 4mm짜리 NaHCO 3, 10mM 자당, 5mM trehalose, 5mM HEPES (산도 7.1의 모든 시약의 준비 시그마 화학). 자당과 trehalose는 세균 오염을 방지하기 위해 사용하는 직전 냉장 주식 솔루션에서 AH에 추가되어 있어야합니다.
- 상온 및 최소한 15 분 공기 버블링에 의해 산소 솔루션 AH 가져와.
- 지방 제거에 필요한 몇 가지 좋은 모세 혈관 (예 : 유리 모세 혈관, 100ul, VWR) 당겨라.
애벌레의 마음
- Sylgard - 코팅 coverslips : 22x22mm coverslip에 Sylgard 솔루션의 50 70μl에 대한 이쑤시개, 전송을 사용합니다. ° C 밤이여 65 Sylgard 강화하자.
- Broadie 및 베이트의 버퍼를 (., 산도 7.15 Broadie와 베이트, 1993을 참조하십시오 135mM NaCl, 5mM KCl, 4mm짜리 MgCl 2, 2mM CaCl 2, 5mM TES, 36mM 자당) 준비합니다.
- histoacryl 접착제를 적용하는 데 필요한 도구를 준비합니다. 첫째, 몇 가지 좋은 모세 혈관 (예 : 과학 제품 GB100T8P) 당기십시오. 튜브에 작은 끝부분을 삽입하여 작은 플라스틱 튜브 (Tygon, 1 / 32 ")와 1.5ml 피펫 팁을 연결합니다. 상대방하기 위해 광범위한 개방과 모세를 삽입합니다. 플라스틱 끝에 접착제 부드러운 흡입의 드롭으로 모세관을 찍기로 Histoacryl 접착제와 모세관을로드합니다. 접착제로 작업할 때 하나는 모세 접착제의 일각에서 과도한 접착제를 제거하기 위해 손을 모세관 두 번째 잔을 있어야합니다. 그것은 몇 초 내에됩니다하든 버퍼 호수와 접촉에 와서까지 접착제는 액체이다. 그러나, 그것은 일반적으로 표본에 적용하면서 접착제 모세관 끝부분에서 또는 제거하기 위해 충분히 플라스틱 남아 있습니다.
성인 플라이에서 세미 그대로 Drosophila 헛
- 성인 Drosophila의 파리 2~5분에 대한 플라이 냅 (캐롤라이나 생물학 공급 주식 회사)와 anesthetized 있습니다. 관리는 더 이상 노출에 대한 플라이 냅에 파리를 떠날하지 않도록해야합니다. 추위에 단기 노출도 파리를 마취하는 데 사용할 수 있지만 더 이상 심장 박동과 rhythmicity에 대한 지속적인 효과를 가지고 같은 CO 2는 권장하지 않습니다.
- Anesthetized 파리는 바셀린의 얇은 레이어 코팅 페트리 접시에, 지느러미 쪽 아래, 배치됩니다. 날개와 본문에 소수성 표피는 reversibly 젤리에 "스틱"하지만 필요한 경우 비행은 재지정 수 있습니다. 이것은 이후의 조작 중에 특히 중요 해지고 있습니다.
- 초기 컷은 봄 가위 곡선 쌍 (Roboz # 5611)를 사용하여 이루어집니다. 가위 블레이드는 다리 아래에 위치하며 목 근처 흉부의 등의 표면을 향해 아래로 직각입니다. 머리, 복부 신경 코드, 그리고 다리가 싱글 컷과 함께 제거됩니다. 준비 그러면 산소, 인공 hemolymph (AH) 솔루션에 빠져들 수 있습니다.
- 스프링 가위를 사용하여 복부 (복부 세그먼트 7 8 구성된)의 뒷부분 끝은 하나의 절단과 함께 제거됩니다. 이것은 복부의 양쪽 가장자리를 따라 수평 상처를 만들기위한 액세스를 제공하고 사후 창자와 복부 표피 사이의 연결을 끊을 수로 제공하고 있습니다. 복부 복부 표피의 해제 플랩을 뺍니다.
- 복부 장기 이제에만 tracheols의 장소에서 개최하므로 3 단계와 4 단계에서 창자의 앞쪽에 및 사후 연결이 절단됩니다. 직감과 다른 복부 장기는 보통 보석의 포셉 (Roboz, # 55)와 울리는 부드러운을 사용하여 하나의 덩어리로 제거할 수 있습니다. 내장을 제거하면 여전히 지방 기관에 의해 둘러싸인 등의 표피에 부착된 박동 심장 튜브를 보여줍니다.
- 지방 시체는 결과적으로 그것이 명확하게 심장 튜브를 참조하기 위해이 지방의 일부를 제거하는 것이 필요 빛을 현미경에 매우 불투명하고 있습니다. 이것은 잘게 그려진 유리 모세관을 사용하여 지방 흡입 기술에 의해 수행됩니다. 모세 혈관은 표준 피펫 풀러 (예 : 서터 P - 97 피펫 풀러)을 사용하여 만든 다음 진공 소스에 부착된 플라스틱 튜브 (Tygon, 1 / 16 ")에 삽입됩니다. 이 시스템은 심장 관 주위의 여분의 지방에서 흡입하는 데 사용됩니다. 직경 40 마이크론보다 큰 팁을 pipettes를 사용하지 않아야하므로 흡입 힘이 팁 직경에 비례합니다. 심장의 후부 일부 지역은 모두 피해야한다 매우 불안정하기 때문에 익스 트림 치료는 심장 자체를 감동 피하고로 이동해야합니다.
- 성인 Drosophila의 심장 관은 현재 노출되고 치고해야합니다. 필요한 경우 표피와 연결되어 마음이 부드럽게 석유 젤리 밖으로 표피를 리프팅 조심스럽게 다시 내려 다림 다시 심장 조직과의 접촉을 피함으로써 재설정하실 수 있습니다. t에서그의 요점은 준비를 목욕 솔루션은 신선한 AHL로 대체해야합니다. 이 준비는 사전에 어떤 조작으로 산소와 20-30분에 대한 평형 수 있어야합니다. 준비 60 분 이상 지속되는 경우 그것은 신선한 AHL과 perfused해야합니다.
광학 녹음에 대한 Immobilizing Drosophila의 애벌레
- Sylgard의 coverslips의 각 모서리에 가까운 Histoacryl 접착제 한 방울을 넣으십시오. 접착제 방울에 B & B 버퍼의 50μl를 추가하는 강화가 즉시됩니다. 접착제는 슬라이드에있는 버퍼를 유지합니다 - B & B와 함께 붙어 장소 사이의 공간을 채우십시오.
- 방랑의 L3 유충을 가지고 2 분 얼음 서부 유럽 표준시 조직 종이에 놓으십시오. 이것은 움직임을 느리게합니다. 그런 다음 버퍼와 방향 등의 측면 접속 (이것은 작은이 벨트 부족 유충의 측면이다)로에 유충을 전송하기만하면됩니다. 신속하게 머리를 지역 및 Sylgard 사이 접착제를 적용합니다. 접착제가 경화는 매우 신속하고 이동에서 유충의 머리를 방지합니다.
- 포셉를 사용하면 조심스럽게 후부 spiracles하여 동물을 잡고 부드럽게 스트레칭. 뒷부분 이분의 일에 유충의 양쪽을 따라 접착제를 적용하여이 위치에 유충을 수정. 동물의 측면에 더 많은 접착제를 추가, 본문 벽의 근육에 의해 표피의 추가 움직임을 줄이기 위해. 유충은 지금이 자리에서 해결되었습니다. coverslip는 AHL 또는 PBS 가득한 작은 페트리 접시에 배치될 수 있습니다. 심장 박동은 지금 몸 벽 움직임의 간섭없이 기록될 수 있습니다.
대표 결과 :
신선한 산소 AH 유지하면 세미 그대로 성인 Drosophila의 마음 (보충 자료를 참조 Ocorr, 외., 2007) 해부 다음 시간 리드미컬 이길 겁니다. 대표 예제는 영화 1 표시됩니다. 제 3 instar의 유충과 젊은 파리 (1 - 3 주 게시 eclosion)에서 마음 - 3 Hz에서 일반적으로 1 사이의 속도로 일반적인 심장 박동을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 마음은 여전히 산소 AHL의 시간 동안 자발적으로 이길 수있는, 삼주가 일반적으로 더 arrhythmic보다 나이가 난다. 해부 프로 시저의 결과로 손상 파리 성충의 마음은 일반적으로 휴식을 취할 수없는 극단적인 수축의 지역화된 영역을 보여줍니다. 따라서 이러한 준비가 손상 것으로 간주되어 버립니다, 1 Hz에서보다 느린 심장 박동 률은 거의 나이 삼주 미만 파리에서 관찰되지 않습니다.
. 영화 1 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오 노출된 복부 심장 관을 보여주는 일주 옛 성인 wildtype을 날게 (W 1,118 연구실 변형) (왼쪽 앞쪽에) -. 정규, 리듬 수축을합니다. 오른쪽 상단에 불투명 지역 나머지 복부 지방 기관되며 심장의 양쪽에 둥근 세포 pericardial 세포 수 있습니다.
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Discussion
Drosophila 모델 embryological 개발에서 학습 및 메모리에 이르기까지 과학 질문 다양한 주소로 사용되었습니다 강력한 유전자 도구로 입증되었습니다. 최근이 다양한 모델 생물이 비행의 심장 기능의 유전자를 조사하는 데 사용되었습니다. 성인 Drosophila의 심장 생리를 정할 시도의 숫자가 복부 표피를 통해 그대로 파리에서 만들어진 관측에 의존합니다. 이러한 방식의 대부분은 하나의 매개 변수, 심장 박동수를 정할 수있는 복부를 통해 빛의 강도 송신기에서 영상 감시하거나 변경 기록에 의존합니다. 어떤 관찰되는 것은 심장의 수축에 보조 지방 단체의 움직임이며, 일반적으로은 심장의 앞쪽에 끝을 관찰 될 수 있으며, 심장에 신경 입력 그대로 :이 방법은 몇 가지 제한이 있습니다. 성인 세미 그대로 준비는 심장 박동 이외에 매개 변수의 개수의 기능 중심 허락 부량의 큰 부분의 자세한보기를 제공합니다. 그것은 기록 절차 (조브 문서를 참조, 1435) electrophysiological 또는 광 사용할 수 있습니다. 또한이 준비 (조브 기사, 1435 참조) histological 조작에 적합합니다. 그것은 또한 PCR에 대해 비교적 깨끗한 심장 조직 샘플로 추출된 수 있으며, 서부는 모래 바닥, microarray 분석 등
Drosophila의 성인 심장이 해부의 목적을 위해 편리하게 alary 근육의 네트워크에 의해 복부의 지느러미 표피에 고정됩니다. 따라서 머리와 복부 거짓말 신경 코드를 멀리 해부하다하고, 다음 심장을 손상하지 않고 내부 장기를 제거하는 것이 가능합니다. 그러나, 심장 복부 세그먼트 6분의 5로 확장 및 맥박 조정기 세포 또는 세포가이 지역에서 의심할 여지없이 존재로 복부만을 매우 팁을를 잘라 3 단계에서 극단주의 주의해야한다.
케어도 해부 동안 마음을 감동 피하기 위해 이동해야합니다. 마음과 접촉이 의심되는 경우에는 준비가 폐기해야합니다. 보통 흡입은 일반적으로 심장 튜브보다 시각화하지만 과도한 흡입에 대한 마음을 둘러싸고 지방과 tracheols의 일부는 또한 심장 손상을 줄 수 제거 충분. 흡입 힘이 주로 지방 흡입에 사용되는 피펫 팁의 크기에 의해 제어되며 약 40 미크론보다 큰 팁은 피해야한다.
성인에서와는 달리, Drosophila의 유충의 심장 관은 뱃속 이동 상대적으로 무료입니다. 따라서 세미 그대로 애벌레 심장 준비는 광 기록 기술에 대한 어려움을 선물한다. 때문에 외피의 반투명으로 그것은 브라이트 현미경을 사용하여 손상 유충의 마음을 시각화 할 수 있습니다. 여기에 설명된 접착제 기술은 발달 단계의 유충을 움직이게하고 고정된 위치에 마음을 유지합니다. 이것은 상대적으로 고정 심장 튜브의 녹음을 수 있습니다. 이러한 고정 유충에 의해 기록된 심장의 수축은 이후 조브 1435에 설명되어있는 광 기록 기술에 의해 분석하실 수 있습니다.
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Acknowledgments
KO는 미국 심장 협회에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
