Summary
Técnica necessária para visualizar o coração batendo em larvas e adultos
Abstract
O
Protocol
Antes de começar a
Coração do adulto
- Recém preparar hemolinfa artificial (AH) solução contendo 108mm Na +, 5mM K +, 2mM de Ca 2 + 8mm, MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, sacarose 10mM, trealose 5mM, HEPES 5mM (pH 7.1, todos os reagentes de Chemicals Sigma). A sacarose e trealose deve ser adicionado ao AH a partir de soluções estoque refrigerado imediatamente antes do uso, a fim de evitar a contaminação bacteriana.
- AH trazer à temperatura ambiente e oxigenar a solução por via aérea borbulhando por pelo menos 15 min.
- Puxe vários capilares finos (por exemplo, capilares de vidro, 100ul, VWR) necessário para a remoção de gorduras.
Corações larval
- Sylgard revestido lamínulas: usando um palito de transferência, de cerca de 50-70μl de solução Sylgard em uma lamela 22x22mm. Deixe o endurecem Sylgard a 65 ° C durante a noite.
- Prepare o Broadie e buffer de Bate (135mm NaCl, KCl 5mM, 4mm MgCl 2, CaCl 2 2mM, TES 5mM, Sacarose 36mm;. PH 7,15 Veja Broadie e Bate, 1993).
- Prepare as ferramentas necessárias para aplicar a cola Histoacryl. Primeiro, puxe vários capilares finos (por exemplo, Ciência Produtos GB100T8P). Conecte uma ponta de pipeta de 1,5 ml com um pequeno tubo de plástico (Tygon, 1 / 32 "), inserindo a extremidade menor para dentro do tubo. Inserir um capilar com a sua ampla abertura para o outro lado. Carregar o capilar com cola Histoacryl por imersão do capilar em uma gota de cola e uma sucção suave na ponta de plástico. Ao trabalhar com a cola deve ter um segundo copo capilar em mãos para remover a cola excessiva da ponta da cola capilar. A cola é líquido até que ele entra em contato com solução salina, onde ele irá endurecer em poucos segundos. No entanto, ele geralmente permanece plástica por tempo suficiente para ser removido da ponta cola capilar ou, aplicando-o ao modelo.
Semi-intactas Coração Drosophila da mosca adulta
- Moscas Drosophila são anestesiados com Nap Fly (Carolina Biological Supply Co.) por 2-5 minutos. É preciso ter cuidado para não deixar as moscas no Nap Fly para exposições mais longas. Exposição a curto prazo ao frio também pode ser usado para anestesiar as moscas, mas CO 2 não é recomendado, pois tem mais efeitos duradouros sobre a freqüência cardíaca e ritmo.
- Anestesiados moscas são colocadas, lado dorsal para baixo, em uma placa de Petri revestida com uma fina camada de vaselina. A cutícula hidrofóbica nas asas e no corpo reversivelmente "pau" para a geléia, mas a mosca pode ser reposicionada, se necessário. Isso se torna especialmente importante durante as manipulações subsequentes.
- Um corte inicial é feita usando um par de tesouras curvas mola (Roboz # 5611). As lâminas de tesoura são colocados sob as pernas e anguladas para baixo em direção a superfície dorsal do tórax perto do pescoço. A cabeça, cordão nervoso ventral, e as pernas são removidos com um único corte. A preparação é então imerso em um hemolinfa, oxigenado artificial (AH) solução.
- Usando a tesoura primavera a ponta posterior do abdômen (composto por segmentos abdominais 7 e 8) é removido com um único corte. Isso fornece acesso para fazer cortes laterais ao longo de ambas bordas do abdome e serve para cortar a ligação entre o intestino posterior e da cutícula abdominal. O retalho livre de cutícula abdominal ventral é então removido.
- Nos passos 3 e 4 as conexões anterior e posterior do intestino são cortados para os órgãos abdominais são agora mantidos no lugar apenas por tracheols. O intestino e outros órgãos abdominais geralmente pode ser removida como uma única massa com a pinça joalheiro (Roboz, # 55) e suave puxando. Remover os órgãos internos revela o tubo coração batendo ainda ligado à cutícula dorsal cercado por corpos de gordura.
- Os corpos de gordura são bastante opacos no microscópio de luz, consequentemente, muitas vezes é necessário remover algumas dessa gordura, a fim de ver o tubo cardíaco claramente. Isto é realizado por uma técnica de lipoaspiração usando finamente desenhadas capilares de vidro. Capilares são feitas usando um padrão pipeta extrator (Eg Sutter P-97 Pipetar Puller) e depois são inseridos em tubos de plástico (Tygon, 1 / 16 ") ligado a uma fonte de vácuo. Este sistema é usado para sugar o excesso de gordura ao redor do tubo de coração. Força de sucção é proporcional ao diâmetro da ponta para pipetas com pontas maiores que 40 mícrons de diâmetro não deve ser usado. Extremo cuidado deve ser tomado para evitar tocar o próprio coração e porque a parte posterior do coração é muito frágil naquela região deve ser evitada.
- O tubo de coração adulto Drosophila está agora exposta e deve ser de bater. Se necessário, o coração cutícula e anexado pode ser reposicionada, delicadamente levantar a cutícula fora da vaselina e cuidadosamente tamping-lo de volta para baixo, novamente evitando qualquer contato com o tecido do coração. Em tseu ponto de vista a solução que banha a preparação deve ser substituído por AHL fresco. Esta preparação deve ser autorizada a estabilizar durante 20-30 minutos com oxigenação antes de qualquer manipulação. Se a preparação deve ser mantida por mais de 60 minutos deve ser perfundido com AHL fresco.
Imobilizando larvas Drosophila para gravação óptica
- Coloque uma gota de cola Histoacryl perto de cada canto do lamínulas Sylgard. Adicionar 50μl de tampão B & B para as gotas de cola que vai endurecer instantaneamente. Preencher o espaço entre os pontos colados com B & B - a cola vai manter o buffer no slide.
- Dê uma vagando larva L3 e colocá-lo em um pedaço de lenço de papel molhado em gelo por 2 min. Isto irá desacelerar seu movimento. Em seguida, transferir a larva no buffer e orientá-la com o lado dorsal para cima (este é o lado da larva que não tem os cintos dentículo). Aplicar rapidamente um pouco de cola entre a região da cabeça e do Sylgard. A cola vai endurecer muito rapidamente e impedir que a cabeça da larva de se mover.
- Utilizando uma pinça cuidadosamente agarrar o animal pela espiráculos posterior e gentilmente esticá-lo. Fixar a larva nesta posição, aplicando a cola ao longo de ambos os lados da larva na metade posterior. Para reduzir ainda mais o movimento da cutícula pelos músculos da parede do corpo, adicione mais cola para os flancos do animal. A larva é agora fixa nesta posição. A lamela pode ser colocado em uma placa de Petri pequena cheia de AHL ou PBS. Batimentos cardíacos podem ser gravados sem a interferência de movimentos parede do corpo.
Resultados representativos:
A semi-intactas adulto coração vai bater ritmicamente Drosophila por horas após a dissecação, quando mantidos em fresco, AH oxigenado (ver Dados Suplementar, Ocorr, et al., 2007). Um exemplo representativo é mostrado no filme 1. Corações de 3 º instar larva e moscas jovens (1-3 semanas após a eclosão) geralmente apresentam um batimento cardíaco regular em taxas entre 1-3 Hz. Voa com mais de três semanas, geralmente são mais arrítmicos, no entanto, esses corações ainda são capazes de bater espontaneamente por horas em AHL oxigenado. Corações em moscas adultas que estão danificados, como resultado do procedimento de dissecção normalmente apresentam regiões localizadas de constrição extremas que são incapazes de relaxar. Taxas de batimento cardíaco mais lento do que 1 Hz são raramente observadas em moscas com menos de 3 semanas de idade, conseqüentemente tais preparações são consideradas danificadas e são descartados.
Clique aqui para baixar Filme 1. - A uma semana fly tipo selvagem de idade adulta (w cepa de laboratório 1118) mostrando o tubo de coração exposto abdominal (anterior à esquerda). Nota regular, contrações rítmicas. Regiões opacas no canto superior direito estão os restantes órgãos de gordura abdominal; células redondas de cada lado do coração são as células do pericárdio.
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Discussion
O modelo de Drosophila provou ser uma poderosa ferramenta genética que tem sido utilizado para tratar uma variedade de questões científicas que vão desde desenvolvimento embrionário para a aprendizagem e memória. Recentemente, este organismo modelo versátil, tem sido usado para investigar a genética da função cardíaca na mosca. Uma série de tentativas para quantificar a fisiologia do coração em adultos Drosophila têm contado com observações feitas em moscas intacta através da cutícula abdominal. A maioria dessas abordagens têm contado com a observação visual ou gravações de alterações na intensidade da luz transmissor através do abdômen para quantificar um único parâmetro, a freqüência cardíaca. Estes métodos têm várias limitações: normalmente só a extremidade anterior do coração podem ser observados, o que está sendo observado é o movimento dos corpos de gordura secundária à contração do coração, ea entrada nervoso para o coração está intacta. A preparação semi-intactas de adultos oferece uma visão mais detalhada de uma grande porção da quantificação coração funcionamento licenciamento de uma série de parâmetros, além de freqüência cardíaca. Ele pode ser usado para eletrofisiológico ou óptico (ver artigo Jove, 1435) procedimentos de gravação. Além disso, esta preparação é adequada para manipulações histológico (ver artigo JOVE, 1435). Também pode ser extraído, como uma amostra relativamente limpo coração de tecido para PCR, análise de Western blotting, microarray, etc
O coração adulto em Drosophila é, para efeitos do presente dissecção, convenientemente fixada à cutícula dorsal do abdômen por uma rede de músculos Alary. Assim, é possível dissecar longe da cabeça e do cordão nervoso ventral mentir, e depois para remover os órgãos internos, sem prejudicar o coração. No entanto, extremo cuidado deve ser tomado na etapa 3 para cortar apenas a ponta muito do abdômen como o coração se estende até segmento abdominal 06/05 e uma célula ou células marca-passo é, sem dúvida, presente nesta região.
Cuidados também devem ser tomadas para evitar tocar o coração durante a dissecção. Se o contato com o coração é suspeita a preparação deve ser descartada. Sucção moderada geralmente é suficiente para remover parte da gordura e tracheols que cercam o coração para melhor visualização do tubo de sucção excessiva do coração, mas também pode danificar o coração. A força de sucção é controlada principalmente pelo tamanho da ponta da pipeta utilizada para a lipoaspiração; dicas maior do que aproximadamente 40 microns devem ser evitados.
Ao contrário do adulto, o tubo cardíaco em larva Drosophila é relativamente livre para se deslocar na cavidade do corpo. Assim, um semi-intactas preparação do coração larval apresenta dificuldades para as técnicas de gravação óptica. Devido à translucidez do tegumento é possível visualizar o coração na larva intacta através de microscopia de campo claro. A técnica descrita aqui cola imobiliza larva de qualquer estágio de desenvolvimento e mantém o coração em uma posição fixa. Isto permite a gravação de um tubo de coração relativamente estacionária. Contrações do coração gravado por larva imobilizado, tais podem ser posteriormente analisadas pela técnica de gravação óptica descrita na JOVE 1435.
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Acknowledgments
KO é apoiado por uma bolsa da American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
