Summary
Questo protocollo dimostra come mantenere sani, indifferenziate staminali embrionali umane (ES) cellule.
Abstract
Staminali embrionali umane (HES), le cellule devono essere monitorati e curati al fine di mantenere sano, culture indifferenziato. Come minimo, le culture devono essere nutriti ogni giorno eseguendo un cambiamento completo di media per ricostituire i nutrienti perduti e per mantenere le culture senza fattori di differenziazione indesiderati. Sebbene una piccola quantità di differenziazione è normale e previsto in colture di cellule staminali, la cultura dovrebbe essere regolarmente ripulito da rimuovere manualmente, o "picking" zone differenziate. Identificare e rimuovere l'eccesso di differenziazione da colture di cellule hES sono tecniche essenziali per il mantenimento di una popolazione sana di cellule.
Protocol
1. Manutenzione: Culture osservare al microscopio
- Rimuovere una piastra di cellule hES dal 37 ° C incubatore e portare al microscopio.
- Osservare le colonie a bassa potenza, con ingrandimento 2X o 5X, per valutare la qualità complessiva della cultura. Tenere presente quanto segue: colore normale media, assenza di contaminazione visibile, la dimensione complessiva colonia, qualità e densità, e altre osservazioni.
- Osservare i cambiamenti di colore medio. A causa del cambiamento del pH e l'esaurimento dei nutrienti nel terreno dopo una notte di incubazione con le cellule HES, la media cambierà da un colore rosso ad un colore "paglia". Se il mezzo sembra viola, una variazione del pH di base si è verificato. Se il mezzo appare estremamente giallo, il mezzo si è acidificato. Mezzo molto giallo può essere il risultato di colonie di estremo sovraffollamento nel pozzo o di contaminazione. Il mezzo deve apparire chiaro in ogni momento. Anche se un certo livello di detriti cellulari nel mezzo è normale, non dovrebbe mai apparire nuvoloso. Se un alto livello di detriti cellulari si osserva, la cultura non è sano e può essere contaminato.
- Se le culture non necessitano di manutenzione o passaging, possono essere adottate per la cappa di sicurezza biologica di essere alimentato (vedi sezione 2).
- Se le culture contengono più del 10% circa differenziare le colonie, le cellule devono essere "ripulita" da rimuovere manualmente le zone differenziate (vedi sezione 3).
- Se le culture contengono colonie di grandi dimensioni o dense o il livello alimentatore MEF è più di 12 giorni, le cellule dovrebbero essere diversi passaggi (vedi sezione 4).
2. Alimentazione hES Cellule
- In un armadio di sicurezza biologica sterile, rimuovere il coperchio del piatto cultura e aspirare il terreno spesi. Non lasciare che la punta della pipetta di toccare qualsiasi parte della targa diversa direttamente all'interno dei pozzi. Se non vi è alcuna preoccupazione di contaminazione, passare a una nuova, pipetta sterile.
- Utilizzando una pipetta sterile di vetro, aggiungere la giusta quantità di caldo terreno di coltura cellulare hES in ciascun pozzetto. Per le culture in un 6-pozzetti, aggiungere 2,5 ml di mezzo di ogni bene.
- Riportare la piastra per l'incubatore di rimanere a 37 ° C e 5% di CO 2.
3. Rimozione differenziazione da colture di cellule hES
- Trasformare da 9 pollici in vetro pipette Pasteur in strumenti di raccolta per stampaggio le punte sopra la fiamma controllata di un bruciatore ad alcol. Assicurarsi che la punta della pipetta è sigillato per evitare contaminazione e arrotondati per evitare di graffiare la plastica del piatto cultura. Sterilizzare gli strumenti di raccolta prima dell'uso utilizzando la fonte di luce UV nella cappa di sicurezza biologica o raccolta custodia.
- Rimuovere le zone differenziate. La differenziazione avviene spesso in solo una parte di una colonia di cellule hES, di solito lungo i bordi o come punti isolati al centro. Se solo una parte di una colonia è differenziare, solo l'area differenziata deve essere rimosso. La differenziazione può spesso sollevare la piastra in un foglio di "appiccicoso", ed è utile per separare prima le cellule differenziate dal resto della colonia disegnando una linea attraverso la colonia con la fine dello strumento di prelievo.
- Una volta che i pezzi della colonia sono separati, dolcemente scivolare lo strumento di raccolta lungo la piastra per staccare le cellule indesiderate. Fare attenzione a non raschiare troppo dello strato di alimentatore MEF tra le colonie in questo processo.
- Quando tutte le cellule differenziate vengono rimosse dalla piastra (e galleggiante nel mezzo), riportare la cultura alla cappa di sicurezza biologica. Aspirare il terreno contenente le cellule differenziate e sostituire con nuove terreno di coltura di cellule HES.
4. Passaging hES Cellule
Enzima Incubazione
- In un armadio di sicurezza biologica sterile, rimuovere il coperchio del 6 ben piatto cultura e aspirare il medio speso dai pozzi di essere diversi passaggi. Non lasciare che la punta della pipetta di toccare qualsiasi parte della targa diversa direttamente all'interno dei pozzi.
- Utilizzando una pipetta sterile di vetro, aggiungere 1 ml di collagenasi IV riscaldato in ciascun pozzetto di essere diversi passaggi.
- Ritorna la piastra ai 37 ° C incubatore per 5 minuti.
Raschiatura e pooling delle Cellule hES
- Dopo aver incubato le cellule con collagenasi, osservare le colonie al microscopio. L'enzima dovrebbe causare un cambiamento sottile ma visibile nei bordi colonia.
- Nella cappa di sicurezza biologica, delicatamente aspirato l'enzima di ogni bene e sostituirlo con medie 2,0 ml di coltura cellulare hES.
- Pendere l'ago della piastra di coltura leggermente verso voi e prendere il medium da 2,0 ml nel primo pozzo con una pipetta di vetro 5 ml. Tenendo la pipetta perpendicolare al fondo del piatto, delicatamente scivolare la punta della pipetta tutto il bene mentre rilasciando lentamente il mezzo.
- Ripetere la raschiatura e pipettitempi di movimento ng 3-4 finché tutte le colonie sono state rimosse dal pozzo. Pipettare delicatamente per evitare di rompere le colonie in troppo piccoli pezzi. Quando le cellule sono state rimosse dal primo pozzo, lasciare i contenuti nel bene e iniziare raschiare le cellule off del prossimo bene.
- Quando tutti i pozzi da diversi passaggi sono stati raschiati, piscina per il supporto contenente i pezzi colonia di ogni bene in un tubo sterile 15 ml.
- Sciacquare i pozzi raschiata con l'aggiunta di 1 ml di terreno di coltura cellulare hES in ciascun pozzetto. Raccogliere questa risciacquare e trasferimento al tubo conico.
- Pipettare delicatamente le cellule nel tubo di rompere i pezzi colonia fino alla dimensione desiderata.
- Centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 x g.
Placcatura Celle cella hES
- Mentre le cellule hES sono nella centrifuga, preparare un nuovo cambio a 6 pozzetti alimentatore MEF. Etichettare il piatto con le informazioni appropriate cellule hES: linea cellulare, numero nuovo passaggio, il passaggio e la data. Aspirare il terreno MEF dai pozzetti e aggiungere 1,0 ml di PBS in ciascun pozzetto. Capovolgere delicatamente il tampone intorno ai pozzi ed aspirare il lavaggio PBS. Aggiungere 1,5 ml di cellule hES terreno di coltura in ciascun pozzetto e impostare il piatto da parte.
- Quando le cellule sono finiti hES centrifugazione, portare la metropolitana per tornare alla cabina di sicurezza biologica. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il vagamente ricco di pellet.
- Risospendere le cellule del pellet con il mezzo sufficiente per 1 ml di terreno di coltura di cellule hES per bene a essere placcato. Quando si divide in 6 nuovi pozzi, risospendere il pellet in 6 ml di mezzo.
- Delicatamente e in modo uniforme aggiungere 1 ml di sospensione cellulare ad ogni preparato pozzetto della piastra di alimentazione MEF.
- Collocare la piastra nel 37 ° C incubatore e con attenzione scorrere la piastra in avanti a indietro, e un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule in tutto il bene.
- Permettono alle cellule di fissare a 37 ° C durante la notte.
5. Rappresentante dei risultati:
Cellule indifferenziate hES sono piccoli, fitto, e di solito consistono di diffusione più grande, più le cellule. La differenziazione può avvenire all'interno di una colonia (Figura 1A) o tra le colonie (Figura 3B).
Morhopologies differenti può essere visto sotto bassi ingrandimenti al microscopio. Una buona morfologia cellulare, come si vede nella Figura 2A, contiene piccole celle fitto che crescono in un monostrato. Le cellule devono essere puliti, bordi definiti, con poco o nessun differenziazione. Le cellule mostrato nella figura 2B sono pronti per passaging, e le cellule mostrato nella Figura 2C sono sovraffollati.
Figura 1. Differenziazione nelle culture hES. (A) la differenziazione di una colonia (B) differenziazione tra colonie.
Figura 2. Morfologie visto nelle culture hES. (A) la morfologia cellulare buono (B), le cellule hES che sono pronti per passaging (C) celle sovraffollate.
Discussion
Sterilità deve essere mantenuto in ogni momento quando si lavora con le cellule HES. Pulire e sterilizzare la cappa di sicurezza biologica e tutte le attrezzature prima dell'uso. Tutti i reagenti devono essere filtrati con un filtro di dimensione dei pori 0,22 micron prima dell'uso. L'uso di antiboiotics in coltura cellulare hES non è necessario e deve essere evitato.
Un ambiente separato deve essere impostato come una stazione di raccolta designato. L'involucro sterile per la stazione può essere un contenitore statico (come ad esempio una workstation PCR) con una sorgente di luce UV, una cappa a flusso laminare, o una cappa di sicurezza biologica. Un microscopio da dissezione all'interno della stazione di prelievo è necessario per osservare le colonie come le zone differenziate vengono rimossi. Il pannello di vetro frontale di un contenitore statico o di una cappa di sicurezza biologica deve essere modificato per consentire la oculari del microscopio per estendere attraverso il pannello senza compromettere il corretto flusso e la sterilità.
Per mantenere sano hES colture cellulari, le cellule devono essere diversi passaggi al momento ottimale, di solito ogni 4-7 giorni. In questo momento le colonie hanno raggiunto la loro dimensione massima e può iniziare ad unire. Colonie unite possono aumentare il tasso di differenziazione nella cultura. Rapporti di Spalato rientrano generalmente 1:03-1:05, a seconda del numero di colonie placcato, il tasso di espansione e condizioni di coltura. Colonie Overplated (rapporto di divisione troppo basso) probabilmente si fondono prematuramente e devono essere diversi passaggi prima che raggiungano la loro dimensione massima.
Culture su uno strato alimentatore MEF che è più di 2 settimane di vita devono essere diversi passaggi a nuove MEF che sosterrà la crescita indifferenziata e la proliferazione.
Dal momento che la differenziazione si verifica naturalmente in colture cellulari hES, una piccola quantità è previsto. Differenziazione frequente o eccessiva può verificarsi se le culture non ricevono cure adeguate. Le cellule devono essere nutriti ogni giorno, crescita eccessiva tra i passaggi dovrebbero essere evitati. Utilizzare sempre i reagenti freschi. Tutti i media, MEF e reagenti devono essere utilizzati entro 14 giorni di tempo per evitare la crescita delle cellule indifferenziate hES. Nuovi lotti di reagenti, come la sostituzione Knockout Serum, FBS e MEF, devono essere sottoposti a screening prima dell'uso. Ricorda che tutte le cellule differenziate non rimossi prima passaging saranno trasferiti alle nuove culture. Inoltre, cercare di mantenere le cellule a 37 ° C, quando possibile. Ridurre al minimo il tempo le cellule passano al di fuori dell'incubatore (ad esempio sul palco microscopio o nella cabina di sicurezza biologica.) Una fase microscopio riscaldata può essere molto utile se le cellule saranno dell'incubatore per lunghi periodi di tempo.
Osservando le colture cellulari hES sotto il microscopio, in primo luogo valutare la qualità complessiva e le dimensioni delle colonie vista con un basso consumo (2x o 5x) obiettivo. Se le cellule potenzialmente differenziati sono osservati a bassa potenza, confermare la morfologia differenziata con un obiettivo più alto ingrandimento (10X).
Immediatamente dopo la rimozione di differenziazione, i bordi delle colonie possono apparire irregolari o danneggiati. Incubare le colonie durante la notte in un mezzo fresco per permettere alle cellule indifferenziate rimanenti per recuperare. Senza l'influenza di differenziazione nella cultura, queste colonie rimanenti continueranno a proliferare normalmente.
Se possibile, iniziare gli esperimenti con basso passaggio cellule HES. Cariotipo delle cellule prima e dopo tutti gli esperimenti più importanti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | 9” glass |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
