Summary
Это видео должно популяризировать коллоидных Кумасси G-250 окрашивания протокол в соответствии с Кан
Abstract
Кумасси бриллиантовый синий (CBB) является красителя обычно используется для визуализации белков, разделенных SDS-PAGE, предлагая простой процедуры окрашивания и высокий количественный. Кроме того, она полностью совместима с масс-спектрометрического идентификации белков. Но, несмотря на эти преимущества, CBB считается, менее чувствительны, чем серебро или флуоресценции окрашивания и поэтому редко используется для обнаружения белка в аналитической гель подходов протеомных.
Несколько улучшений оригинальной Кумасси протокол 1 были внесены повысить чувствительность CBB. Два основных изменения были внесены для повышения вероятности обнаружения низкого обильные белки путем преобразования молекул красителя в коллоидных частиц: В 1988 году Neuhoff и коллеги применяется 20% метанола и более высокие концентрации сульфата аммония в CBB G-250 решение на базе окрашивания 2, а в 2004 году Candiano и соавт. создана Blue Silver использованием CBB G-250 с фосфорной кислотой в присутствии сульфата аммония и метанола 3. Тем не менее, все эти изменения просто позволить обнаружения приблизительно 10 нг белка. Широко неизвестный протокол для коллоидного окрашивания Кумасси был опубликован Кан и соавт. В 2002 году, где они изменение коллоидного окрашивания CBB Neuhoff в протокол о комплексообразующих веществ. Вместо того, сульфат аммония они использовали сульфат алюминия и метанола была заменена менее токсичны этанола 4. Роман на основе алюминия, окрашивание в исследовании Кан показал высокую чувствительность, которая обнаруживает, даже в 1 нг / полоса (фосфорилазы б) с небольшим изменением чувствительности в зависимости от белков.
Здесь мы демонстрируем применение протокола Канга для быстрого и чувствительного коллоидного окрашивания Кумасси белков в аналитических целях. Мы проиллюстрируем быстрый и легкий протокол, используя двумерный гель регулярно проводится в нашей рабочей группы.
Protocol
Часть 1: двумерные (2-D) гель-электрофореза использованием чашки загрузкой
- IPG-полосы регидратации и изоэлектрической фокусировки (МЭФ)
- Увлажняет Immobiline DryStrip гели, рН 6-11 (7 см) в 125 мкл раствора регидратации [7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide мм и 2% IPG буфера рН 6-11] с помощью Immobiline DryStrip Reswelling лоток для по крайней мере 10 часов.
- Растворите осажденный образец белка в буфере образца ИЭФ [7 М мочевины, тиомочевины 2 M, 2% CHAPS, 2% АСБ-14, 50 hydroxyethyldisulfide мм и 2% IPG буфера рН 6-11], соответствующие 60-100 мкг белка на 100 мкл .
- После растворения (не менее 30 минут при комнатной температуре), нанесите белок образца через анодный чашку загрузкой использованием образца чашки. Объем чаши составляет 100 мкл (многообразие чашки позволяют до 150 мкл).
Обратите внимание: вы можете загрузить большее количество образцов, если Вы вставите низковольтных шаг в начале фокусировки протокол и пополнить чашки, пока еще есть пленки жидкости в чашке! - Выполните изоэлектрической фокусировки для 11,1 KVH в градиентном режиме в Электрофорез Группа Multiphor II.
- Уравновешивание и SDS-PAGE
- После МЭФ, IPG полосы были подвергнуты сокращению и алкилирования, каждый раз 15 минут на шейкере, используя 1% дитиотреитол и 2,5% соответственно, в iodoacetamide равновесия решение [50 мМ Tris-HCl/pH 8,8, 6 М мочевина, глицерин 30% и 2% SDS].
- Промыть уравновешенной полосы с Н 2 О и промокните их на ватмане, чтобы удалить излишки буфера уравновешивания. После падения полос в SDS-работает буфером (1х).
- Второе измерение производится SDS-PAGE на вертикальные системы электрофорез с общей концентрации акриламида в 12%. Уравновешенной полосы IPG были размещены на верхней части разделения гели и фиксируется с горячим раствором агарозы [0,5% агарозном в управлении буфер, содержащий бромфенола синий].
- Белки были разделены в течение 2,5 часов, начиная с 80 В в течение 15 минут, затем 120 В до красителя фронт достигнет нижней части геля кассету.
Часть 2: Коллоидное окрашивание Кумасси с CBB G-250
1. Окрашивание решения
Примечание: для подготовки окрашивания решений, использование химических веществ с высоким качеством, таких как аналитические класса (в год) и водой высокого качества, как вы получите от Millipore систем (Milli-Q воды).
| Кумасси решение: | объявление 2000 мл H 2 O | |
| 0,02% (м / о) | CBB G-250 | 0,4 г |
| 5% (м / о) | сульфата алюминия-(14-18)-гидрат | 100 г |
| 10% (объем / объем) | этанол (96%) | 200 мл |
| 2% (об. / об) | ортофосфорной кислоты (85%) | 47 мл |
Примечание: для подготовки красящим раствором, последовательного добавления компонентов в следующем порядке должна быть сохранена:
- первый растворяются сульфата алюминия в Milli-Q воды
- после этого добавить этанол, гомогенизации, и соединение CBB G-250 для решения
- не далее как решение полностью не растворится, добавляют фосфорную кислоту (включение кислоты спиртовых средах позволяет Кумасси молекул в их совокупности коллоидное состояние)
- наконец пополнить с Milli-Q воды
Примечание: окончательное решение окрашивания имеет темно-зеленые, голубоватые внешний вид и полное частиц плавание вокруг:
- Не фильтрата это решение!
- Если вы изменили порядок подготовки, вы получите более фиолетово-голубоватого решение, которое является менее чувствительной.
| Destaining решение: | объявление 2000 мл H 2 O | |
| 10% (объем / объем) | этанол (96%) | 200 мл |
| 2% (об. / об) | ортофосфорной кислоты (85%) | 47 мл |
2. Процедура окраски
- После второго разделения измерение, осторожно удалить гель из стеклянных пластин и передача их в сосуд для окрашивания заполнены Milli-Q воды.
- Вымойте гели три раза Milli-Q воде в течение 10 минут на горизонтальной шейкере (недостаточное мытье причины низкой чувствительности, так как остальные SDS на гели нарушает ограничивающий из красителя с белком).
- Встряхните решение Кумасси перед использованием, чтобы разогнать коллоидные частицы равномерно.
- Инкубируйте гели хорошо покрыты решение Кумасси по агитации на шейкере в течение 2-12 часов. Это окрашивание создает маргинальные фоновом режиме, поэтому вы можете наблюдать окрашивание прогресса между ними.
Примечание: через 10 минут вы можете увидеть первые пятна появляются белок, в течение 2 часов инкубации около 80% окрашивания к немус максимальным уровнем завершена. В течение почти 100% окрашивание, ночной инкубации рекомендуется. В некоторых случаях, когда количество белка, чтобы быть окрашены огромен и решение превращается в ярко-синий, обновления красящим раствором необходимо. - После окрашивания процедуру удаления решение Кумасси и ополосните гели дважды Milli-Q воды.
Обратите внимание: вы можете использовать красящим раствором тех пор, пока частицы оставаясь, в противном случае отказаться от него (имейте в виду, что ваша лаборатория может иметь специальные правила по утилизации отходов). - Удалить прилипания частиц красителя от окрашивания блюдо с безворсовой бумажным полотенцем и destain на 10 - 60 минут.
Примечание: Вы также можете мыть гели только с Milli-Q воду, но этого мы рекомендуем только для препаративного гели, потому что будет длиться нерегулярный, слабый фильм Кумасси на гели, которые будут возникать во время процедуры сканирования. - Наконец полоскание гели дважды Milli-Q воды: гели достигнет своей первоначальной толщины (алкоголя, кислых средах делает гели сокращение) и нейтрализации в воде дополнительно усиливает интенсивность цвета в Кумасси.
Часть 3: Представитель результаты
Если вы будете следовать протоколу, описанных выше, вы получите на свой 2-D геле отличительные решен и хорошо окрашенные темно синие пятна белка. Даже по сравнению с 2-D гель окрашивали серебром в соответствии с Шевченко и соавт. 5, протокол утверждая, хорошую чувствительность и совместимость с масс-спектрометрии, мы достигаем равные результаты окрашивания.
Рисунок 1: Окончательный результат экспериментов, описанных выше. Канга Кумасси протокол () выполняет сильно, как окрашивания серебром в соответствии с Шевченко и соавт. (B) для выявления белков после 2-D электрофореза геля.
Часть 4: Советы и рекомендации
- Выполните несколько пробных окрашивания перед обработкой собственных образцов. Для необъяснимым причинам мы сообщали, что иногда белок не был обнаружен успешно, даже если миллиграмм были применены. В этом случае мы рекомендуем подготовить некоторые серии разведений для проверки чувствительности.
- Если у вас низкий в-гель обнаружения белка (ы) в общем, неудачный трансфер из укладки на разделяющей геля во время SDS-PAGE, возможно, будет причина. Вы можете проверить наличие таких липких белков окрашиванием полный геля в том числе укладки области.
- Для быстрой проверки вашей изоэлектрофокусировки результатов, вы можете напрямую пятно IPG-посадочных полос без дальнейшего разделения второе измерение.
- Изредка в свою очередь, гели во время окрашивания процедуры, чтобы они равномерно окрашенный с обеих сторон (если вы продолжаете гели равнодушным, краска просто связывается с одной стороны гель).
- Мы испытали, что хранение окрашивание раствора в темную бутылку увеличивает ее срок службы (в прозрачных бутылках до 4 месяцев).
- После окрашивания и документирования вы можете хранить гель в холодильнике в течение нескольких лет (если добавить кислого раствора вам избежать загрязнений грибами).
- Destaining геля зажигания для триптического переварить можно ускорить потепление в нагревательный блок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инновационные или просто еще один протокол Кумасси?
На данный момент существует множество протоколов для окрашивания процедуры Кумасси бриллиантовый синий. Большинство из них возникают незначительные или значительные изменения одного из наиболее широко используемых протоколов Neuhoff и коллег 2. Также протокол Канга по формуле Neuhoff в. Но действительно ли это альтернативное окрашивание Кумасси метод протеомных исследований? Мы будем картина два основных вопроса, предел обнаружения и удобством использования, доказательства того, что это определенно полезно протокол окрашивания по сравнению с другими протоколами Кумасси и даже серебро и флуоресцентные окрашивания.
Фокус I: предел обнаружения
В публикации Кан, они обнаружили несколько белков-маркеров до 1 нг / полоса (рис. 2). Но на наш взгляд, предел обнаружения 4-8 нг / группа, скорее всего, связано с практикой (таблица 1). Кроме того, они обсуждали высочайшие уровни чувствительности по отношению к обоим коллоидных Кумасси протокол с CBB G-250 в фосфорную кислоту, сульфат аммония и метанола и кислой окрашивания серебра (Silver пятна Plus Kit) с помощью биотехнологии Amersham Pharmacia.
Рисунок 2: Представитель SDS-гель опубликованные Кан и соавт. , что демонстрирует силу изменение CBB-G250 протокола. 250 нг / группа белков были загружены в самый левый и 2-кратный разбавляют до правой стороны последовательно.
Таблица 1: Окрашивание пределы стандартных белков взяты из публикации Канга по сравнению с более реалистичными порог обнаружения белка.
| Белок | МВт [кДа] | Белки количество [нг] (виртуальный против серьезных) |
| миозин | 220 | 1 / 4 |
| б-галактозидазы | 116 | 1 / 4 |
| фосфорилазы б | 97 | 1 / 4 |
| бычьего сывороточного альбумина | 66 | 2 / 4 |
| овальбумина | 45 | 4 / 8 |
Для подтверждения этих пределов обнаружения и для дальнейшей проверки окрашивания методом Канга мы провели нашу собственную серию испытаний на общих Laemmli SDS-гели с маркеры молекулярного веса обнаружено коммерчески доступных флуоресцентных решения окрашивания как Sypro Ruby (BioRad) и Deep Purple (GE Healthcare) (рис. 3). Интересно, что Канга окрашивание оценки, хорошо или даже работает лучше (в случае Deep Purple) и, следовательно, безусловно, лучший с точки зрения трудоемкости и производительности!
Рисунок 3: Сравнение CBB-G250 основе окрашивания Канга () с Sypro Ruby (Б) и Deep Purple (GE Healthcare) (рис. 3). (C) окрашивание белка полосы в SDS-PAGE. Маркер молекулярного веса содержащих фосфорилазы б (97,4 кДа), БСА (66,2 кДа), яичный альбумин (45 кДа), карбоангидразы (31 кДа), ингибитор трипсина сои (21,5 кДа) и лизоцима (14,4 кДа) была проанализирована, с белком количествах 1 г / полоса с левой стороны гель и последовательно разбавляют в 2 раза с правой стороны.
Тем не менее, эти пределы обнаружения определялись со стандартными белки используются для маркеры молекулярного веса и должны рассматриваться с осторожностью. По этой причине, мы дополнительно протестированы методом окрашивания Канга с различными белками, которые частично имеют слабое сродство к CBB (например fetuin, MYCIN). Как показано на рисунке 4, протокол Канга превосходит обычные окрашивания CBB и даже работает лучше, чем Sypro Ruby, но не приходит до окрашивания серебром в этом случае. Однако мы считаем, изменение окраски методом Кан является выдающимся альтернативой для чувствительной и быстро белка обнаружения в гелевой основе протеомики.
Рисунок 4: Белок окрашивание fetuin с () коллоидные Канга Кумасси протокола (без destaining) по сравнению с (В) обычных CBB G-250 окрашивания (40 метанола% и 10% уксусной кислоты), (C) Sypro Рыбы и (D ) окрашивания серебром в соответствии с Шевченко и соавт. Белки количества 2 г разбавленный до 2 нг были загружены на SDS-PAGE.
Focus II: юзабилити
Помимо улучшения пределов обнаружения делает Канга Кумасси протокол предлагает несколько функций, что делает его по отношению к льготным окрашивания из Neuhoff или Candiano и даже флуоресценции протоколов:
- фиксации и окраски производится за один шаг
- не более 4 шагов во всех
- Первые результаты окрашивания быстро видны (в большинстве случаев в течение менее 20 минут)
- Процедура требует лишь 2 часа на 80% завершение окрашивания
- простоминимальное окрашивание фона
- окрашивание процедура очень воспроизводимые (это конечная точка метод)
- не более, обращение с токсичными спирт (метанол заменен этанолом)
- Решение почти без запаха (без использования уксусной кислоты)
- Использование CBB G-250 в низких концентрациях.
Таким образом, формула довольно удобно, относительно безопасных, экологически чистые и дешевые. Кроме того окрашивания Канга полностью совместим с массовых анализов спектрометрии. В итоге можно сказать, что окрашивание Кумасси Канга отлично подходит для быстрого и аналитических в-гель обнаружения белков даже для протеомики подходы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мне нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Никола Wiethölter для подготовки и окрашивания 1-D гелей.
Эта работа финансировалась за счет гранта Deutsche Forschungsgemeinschaft (ГРК 1089/project 5 до Н. Д. и С. М.) и при поддержке исследований общении с Юргеном Manchot Stiftung в НД.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| staining dishes with lids | VWR international | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck & Co., Inc. | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
