Summary
يجب نشر هذا الفيديو الغروية Coomassie a G - 250 وفقا لبروتوكول تلطيخ كانغ
Abstract
Coomassie بريليانت الأزرق (المصرف المركزي) هو صبغ يشيع استخدامها لتصور للبروتينات مفصولة SDS - PAGE ، وتقدم على إجراء تلوين بسيطة والكميات العالية. وعلاوة على ذلك ، وهو متوافق تماما مع الكتلة الطيفي تحديد البروتين. لكن على الرغم من هذه المزايا ، يعتبر المصرف المركزي إلى أن تكون أقل حساسية من الفضة أو stainings مضان ، وبالتالي نادرا ما تستخدم للكشف عن البروتينات في النهج التحليلي القائم على البروتين هلام.
أدخلت تحسينات عديدة من 1 أصلية Coomassie بروتوكول لزيادة حساسية المصرف المركزي. تطبيق Neuhoff وزملاؤه في عام 1988 ، والميثانول بنسبة 20 ٪ وتركيزات أعلى من كبريتات الامونيوم في G - 250 المصرف المركزي حل يستند تلطيخ 2 : أدخلت تعديلين رئيسية لتعزيز الكشف عن البروتينات المنخفضة وفيرة عن طريق تحويل الجزيئات إلى جزيئات صبغة الغروية وفي عام 2004 آخرون Candiano. أنشئ المصرف المركزي باستخدام الأزرق الفضي G - 250 مع حامض الفوسفوريك في وجود كبريتات الامونيوم والميثانول 3. ومع ذلك ، فإن جميع هذه التعديلات تسمح فقط للكشف عن البروتين حوالي 10 نانوغرام. ونشرت على نطاق واسع لبروتوكول fameless تلطيخ Coomassie الغروية التي كانغ وآخرون في عام 2002 حيث تعديل Neuhoff تلوين المصرف المركزي الغروية بروتوكول بشأن المواد complexing. بدلا من كبريتات الامونيوم سلفات الألمنيوم استخدامها واستعيض الميثانول من 4 الإيثانول أقل سمية. وأظهرت القائمة على الألمنيوم في دراسة الرواية تلوين كانغ الحساسية الفائقة التي يكشف منخفضة مثل 1 نانوغرام / فرقة (فسفوريلاز ب) مع قليل من الاختلاف حساسية اعتمادا على البروتينات.
هنا ، علينا أن نظهر تطبيق بروتوكول كانغ لسريع وحساسة تلطيخ Coomassie الغروية من البروتينات في أغراض التحليلية. وسوف نوضح بروتوكول سريعة وسهلة باستخدام ثنائية الأبعاد المواد الهلامية بصورة روتينية في مجموعتنا العمل.
Protocol
الجزء 1 : ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام (2 - D) باستخدام كوب التحميل
- IPG - الشريط الإماهة والتركيز كهرساوي (IEF)
- ترطيب المواد الهلامية DryStrip Immobiline ، ودرجة الحموضة 6-11 (7 سم) في 125 حل الإماهة ميكرولتر [7 M اليوريا ، 2 M ثيويوريا ، الفصلان 4 ٪ ، و 50 ملم وhydroxyethyldisulfide 2 ٪ IPG الحموضة الاحتياطي 11/06] باستخدام Immobiline صينية لDryStrip Reswelling لا يقل عن 10 ساعة.
- حل عجل عينة البروتين في عينة العازلة IEF [7 M اليوريا ، 2 M ثيويوريا ، الفصلان 2 ٪ و 2 ٪ ASB - 14 ، hydroxyethyldisulfide 50 ملم و 2 ٪ IPG الحموضة الاحتياطي 11/06] بروتين الموافق 6-10 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر .
- بعد solubilization (على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) ، وتطبيق نموذج البروتين عبر انوديك كأس الكؤوس التحميل باستخدام عينة. حجم الكوب هو 100 ميكرولتر (كوب المنوع سماح تصل إلى 150 ميكرولتر).
ملاحظة : يمكنك تحميل كميات أكبر عينة إذا قمت بإدراج خطوة ذات الجهد المنخفض في بداية البروتوكول التركيز وإعادة ملء أكواب في حين لا يزال هناك فيلم السائل في الكوب! - التركيز على أداء كهرساوي kVh 11.1 في وضع التدرج في الكهربائي Multiphor الوحدة الثانية.
- موازنة وSDS PAGE -
- بعد IEF ، تعرض شرائط IPG للحد من وألكلة ، في كل مرة 15 دقيقة على شاكر ، وذلك باستخدام dithiothreitol 1 ٪ و 2.5 ٪ على التوالي iodoacetamide في حل موازنة [50 ملي Tris-HCl/pH 8.8 ، 6 M اليوريا والجلسرين 30 ٪ و 2 ٪ SDS].
- شطف شرائح معايرتها مع H 2 O وصمة عار لهم على الورق لإزالة الزائدة whatman موازنة العازلة. بعد ذلك تراجع الشرائط في SDS الامد العازلة (1X).
- يتم تنفيذ البعد الثاني بواسطة SDS - PAGE على النظم العمودي الكهربائي مع تركيز مادة الأكريلاميد ما مجموعه 12 ٪. وضعت شرائط IPG معايرتها على الجزء العلوي من المواد الهلامية التي تفصل وثابتة مع الحل agarose الساخنة [agarose 0.5 ٪ في تشغيل العازلة التي تحتوي على الأزرق bromophenol].
- تم فصل البروتينات لمدة 2.5 ساعة ، ابتداء من الساعة 80 V لمدة 15 دقيقة تليها حتى 120 فولت الجبهة صبغ يصل الجزء السفلي من الكاسيت هلام.
الجزء 2 : صمغي Coomassie تلطيخ مع المصرف المركزي G - 250
1. تلطيخ حلول
ملاحظة : لإعداد الحلول التلوين ، واستخدام المواد الكيميائية ذات جودة عالية مثل الصف تحليلية (سنويا) والمياه عالية النقاء كما تحصل من أنظمة ميليبور (الملة - Q الماء).
| Coomassie الحل : | 2000 م مل H 2 O | |
| 0.02 ٪ ث (/ V) | المصرف المركزي G - 250 | 0،4 ز |
| 5 ٪ (W / V) | كبريتات الالومنيوم (14-18) هيدرات | 100 غرام |
| 10 ٪ (V / V) | الإيثانول (96 ٪) | 200 مل |
| 2 ٪ (V / V) | حمض orthophosphoric (85 ٪) | 47 مل |
ملاحظة : لإعداد الحل تلوين ، إضافة متسلسلة من المكونات الموجودة في الترتيب التالي لابد من المحافظة :
- حل first كبريتات الألمنيوم في الملة - Q المياه
- بعد ذلك إضافة الإيثانول ، التجانس ، ومزيج المصرف المركزي G - 250 إلى الحل
- في الآونة الأخيرة كما يذوب تماما الحل ، إضافة حامض الفوسفوريك (دمج الحامض إلى وسائل الإعلام الكحولية يتيح للجزيئات Coomassie الكلي في دولتهم الغروية)
- شغل أخيرا مع الملة - Q المياه
ملاحظة : الحل النهائي وتلطيخ مظلم الاخضر المزرق ومظهر ممتلئ من الجسيمات السباحة حول ما يلي :
- لا رشاحة هذا الحل!
- إذا قمت بتغيير النظام من الإعداد ، سوف تحصل على حل أكثر البنفسجي المزرق الذي هو أقل حساسية.
| Destaining الحل : | 2000 م مل H 2 O | |
| 10 ٪ (V / V) | الإيثانول (96 ٪) | 200 مل |
| 2 ٪ (V / V) | حمض orthophosphoric (85 ٪) | 47 مل |
2. تلطيخ الداخلي
- بعد انفصال البعد الثاني ، وإزالة المواد الهلامية بعناية من لوحات الزجاج ونقلها الى صحن مليء تلطيخ الملة - Q المياه.
- غسل المواد الهلامية ثلاث مرات مع الملة - Q الماء لمدة 10 دقيقة على شاكر الأفقي (غسل أسباب حساسية كافية لأن الفقراء SDS المتبقية على المواد الهلامية يزعج المحيط للصبغ للبروتين).
- هزة الحل Coomassie قبل الاستخدام لتفريق الجسيمات الغروية بالتساوي.
- احتضان والمواد الهلامية بتغطية جيدة مع الحل Coomassie بواسطة التحريض على شاكر ل12/02 ساعة. هذا يولد تلوين الخلفية الهامشية بحيث يمكنك مراقبة التقدم المحرز في تلطيخ بينهما.
ملاحظة : بعد 10 دقيقة يمكن أن تشاهد بقع البروتين تظهر للمرة الاولى ، في حدود 2 ساعة من الحضانة حوالي 80 ٪ تلطيخ إليهااكتمال ق أقصى مستوى. لتلطيخ ما يقرب من 100 ٪ ، فمن المستحسن الحضانة بين عشية وضحاها. في بعض الحالات ، عندما كمية من البروتين ليكون ملون ضخم والحل يتحول إلى زرقاء لامعة ، والتحديث من الحل تلطيخ ضروري. - بعد هذا الإجراء إزالة البقع الحل Coomassie وشطف الهلام مرتين مع الملة - Q المياه.
ملاحظة : يمكنك إعادة تلوين الحل طالما الجزيئات التي لا تزال قائمة ، وإلا فإنه تجاهل (نضع في اعتبارنا أن المختبر الخاص قد يكون لها لوائح خاصة للتخلص من النفايات). - إزالة الجسيمات العالقة صبغة تلوين من الطبق مع خالية من الوبر منشفة ورقية ويزيل اللون لمدة 10 -- 60 دقيقة.
ملاحظة : يمكنك أيضا غسل المواد الهلامية فقط مع الملة - Q المياه ولكن هذا نوصي فقط عن المواد الهلامية التحضيرية سوف تستمر لأن هناك غير منتظمة ، والأفلام Coomassie ضعيف على المواد الهلامية التي سوف تنشأ أثناء إجراء المسح. - أخيرا شطف الهلام مرتين مع الملة - Q المياه : سوف يصل سمك الهلام الأصلي (وسائل الإعلام الكحول والحامض يجعل تقلص المواد الهلامية) ، وتحييد في المياه بالإضافة إلى ذلك يعزز من كثافة Coomassie اللون.
الجزء 3 : نتائج الممثل
اذا كنت تتبع البروتوكول المذكورة أعلاه سوف تحصل على جهاز D - 2 الجل الملون وكذلك حل الظلام المميزة البقع الزرقاء البروتين. حتى بالمقارنة مع هلام 2 - D ملطخة الفضة وفقا لآخرون شيفتشينكو 5 ، بروتوكول يدعي حساسية جيدة والتوافق مع مطياف الكتلة ، أن نحقق نتائج تلطيخ متساوية.
الشكل 1 : النتائج النهائية للتجارب المذكورة أعلاه. كانغ Coomassie البروتوكول (أ) ينفذ بقوة مثل الفضة وفقا لتلطيخ آخرون شيفتشينكو (B) في الكشف عن البروتينات بعد 2 - D هلام إستشراد.
الجزء 4 : نصائح والخدع
- أداء بعض stainings اختبار قبل معالجة العينات الخاصة بك. غير قابل للتفسير لأسباب ذكرت في بعض الأحيان نحن لا يمكن أن بروتين يتم الكشف عن الاهتمام بنجاح حتى عندما طبقت ملليغرام. في هذه الحالة نوصي لإعداد سلسلة تخفيف بعض لاختبار الحساسية.
- إذا كان لديك منخفضة في جل اكتشاف بروتين (ق) في نقل عامة ناجحة من التراص إلى هلام خلال فصل SDS - PAGE ربما يكون السبب. يمكنك الاختيار لزجة مثل البروتينات التي تلطيخ الجل كاملة بما في ذلك منطقة التراص.
- عن التحقق من النتائج بسرعة تساوي الكهربية الخاص مع التركيز ، يمكنك صمة مباشرة شرائط IPG من دون أي فصل البعد الثاني أخرى.
- بدوره أحيانا المواد الهلامية أثناء الإجراء بحيث يتم تلوين ملطخة أنها بالتساوي من كلا الجانبين (إذا كنت تحتفظ المواد الهلامية غير متأثر ، وصبغ يربط فقط لجانب واحد من هلام).
- شهدنا أن تخزين الحل تلطيخ في زجاجة داكنة يزيد من عمر البطارية (في زجاجات شفافة تصل إلى 4 أشهر).
- بعد التلوين وتوثيق تتمكن من الحفاظ على المواد الهلامية في الثلاجة لعدة سنوات (إذا قمت بإضافة المحاليل الحمضية يمكنك تجنب التلوث بواسطة الفطريات).
- يمكن التعجيل Destaining من المقابس هلام لهضم تريبسيني عن الاحترار في سخان كتلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الابتكارية أو مجرد بروتوكول Coomassie؟
في هذه اللحظة توجد بروتوكولات متعددة لتلطيخ الاجراءات مع Coomassie بريليانت الأزرق. معظمهم نتيجة تعديلات طفيفة أو كبيرة واحدة من البروتوكولات الأكثر استخداما من قبل الزملاء وNeuhoff 2. أيضا بروتوكول كانغ استنادا إلى الصيغة التي Neuhoff. ولكن هل هو حقا تلطيخ Coomassie طريقة بديلة للبحوث البروتين؟ سنقوم صورة مسألتين رئيسيتين ، والحد من الكشف والاستخدام ، لدليل على أنه بالتأكيد بروتوكول تلطيخ مفيدة مقارنة البروتوكولات الأخرى وCoomassie stainings الفضة وحتى الفلورسنت.
يركز الأول : حد الاكتشاف
في المنشور كانغ ، والكشف عن البروتينات التي علامة عدة تصل إلى 1 نانوغرام / فرقة (الشكل 2). ولكن في رأينا هو أكثر احتمالا متعلق حد الكشف عن نانوغرام 08/04 / فرقة لممارسة (الجدول 1). انهما ناقشا كذلك مستويات حساسية فائقة بالنسبة إلى كل من بروتوكول Coomassie الغروية مع المصرف المركزي G - 250 في حامض الفوسفوريك ، وكبريتات الامونيوم والميثانول ، وتلطيخ الفضة الحمضية (فضية اللطخة بلس كيت) من التكنولوجيا الحيوية أمرشام فارماسيا.
الشكل 2 : الممثل SDS جل نشرتها كانغ وآخرون. هذا يدل على قوة المصرف المركزي بروتوكول - G250 تعديلها. تم تحميل 250 نانوغرام / فرقة البروتينات في اليسار الأكثر ضعفا و 2 المخفف إلى الجانب الأيمن على التوالي.
الجدول رقم 1 : حدود لتلطيخ القياسية البروتينات المأخوذة من منشورات كانغ في المقارنة إلى عتبة أكثر واقعية للكشف عن البروتين.
| بروتين | ميغاواط [كيلو دالتون] | كمية البروتين [نغ] (الظاهري مقابل خطيرة) |
| الميوسين | 220 | 04/01 |
| ب. غالاكتوزيداز | 116 | 04/01 |
| فسفوريلاز ب | 97 | 04/01 |
| ألبومين المصل البقري | 66 | 04/02 |
| ovalbumin | 45 | 08/04 |
لتأكيد هذه حدود الكشف ، وإلى مزيد من التحقق من صحة الأسلوب كانغ تلوين أجرينا سلسلة لدينا الاختبار الخاصة على المشترك المواد الهلامية - SDS Laemmli مع علامات الوزن الجزيئي الكشف عنها بواسطة متوفرة تجاريا حلول تلطيخ الفلورسنت مثل روبي Sypro (BioRad) وديب بيربل (GE للرعاية الصحية) (الشكل 3). ومن المثير للاهتمام ، وعشرات كانغ تلوين جيدا أو حتى أداء أفضل (في حالة ديب بيربل) ، ولذا فإنها بالتأكيد متفوقة من حيث مدخلات العمل والأداء!
الشكل 3 : مقارنة بين المصرف المركزي تلطيخ - G250 المستندة كانغ (A) مع روبي Sypro (B) ، وديب بيربل (GE للرعاية الصحية) (الشكل 3). (C) تلطيخ العصابات البروتين في SDS - PAGE. وتم تحليل علامة الوزن الجزيئي يتضمن فسفوريلاز ب (97.4 كيلو دالتون) ، BSA (66.2 كيلو دالتون) ، ovalbumin (45 كيلو دالتون) ، فحمي الأنهيداز (31 كيلو دالتون) وفول الصويا مثبط التربسين (21.5 كيلو دالتون) والليزوزيم (14.4 كيلو دالتون) ، مع كميات من البروتين من 1 غرام / الفرقة في الجانب الأيسر من الجل والمخفف على التوالي 2 أمثالها إلى اليمين
ومع ذلك ، تم تحديد هذه الحدود مع الكشف عن البروتينات العلامات القياسية المستخدمة في الوزن الجزيئي وينبغي النظر بحذر. لهذا السبب ، بالإضافة إلى الأسلوب اختبرنا كانغ تلوين مع البروتينات المختلفة التي تقارب ملزم جزئيا لضعف المصرف المركزي (مثل فتوين ، mycin). كما هو موضح في الشكل 4 ، والبروتوكول كانغ هي متفوقة على تلطيخ المصرف المركزي التقليدية وحتى أفضل من ينفذ Sypro روبي ، ولكن لا يأتي إلى تلطيخ الفضة في هذه القضية. ومع ذلك ، فإننا نعتقد طريقة تلوين تعديل كانغ هو بديل عن اكتشافات المعلقة البروتين حساس وسريع في جل المستندة البروتيوميات.
الشكل 4 : تلطيخ البروتين من فتوين مع (A) كانغ بروتوكول Coomassie الغروية (بدون destaining) مقارنة ب (B) تقليدية المصرف المركزي G - 250 تلطيخ (40 الميثانول ٪ وحمض الخليك 10 ٪) ، (C) Ryby Sypro و (D ) الفضة وفقا لتلطيخ آخرون شيفتشينكو. تم تحميل كميات من البروتين 2 غرام الواحد لتصل إلى 2 نانوغرام للSDS - PAGE.
التركيز الثاني : قابلية الاستخدام
بجانب حدود الاكتشاف لا تحسن كانغ Coomassie بروتوكول تقديم العديد من الميزات التي تجعلها تفضيلية تجاه stainings من Neuhoff أو Candiano والبروتوكولات حتى مضان :
- تحديد وتلطيخ تتم في خطوة واحدة
- لا أكثر من 4 في جميع الخطوات
- الأولى هي النتائج تلطيخ مرئية سريع (في معظم الحالات في غضون أقل من 20 دقيقة)
- الإجراء يتطلب فقط 2 ساعة لاستكمال 80 ٪ من تلطيخ
- فقطالحد الأدنى من الخلفية تلطيخ
- الإجراء هو تلطيخ استنساخه جدا (وهو أسلوب نقطة النهاية)
- لا مزيد من التعامل مع الكحول السامة (يتم استبدال الميثانول بواسطة الايثانول)
- الحل هو عديم الرائحة تقريبا (أي استخدام حمض الخليك)
- استخدام المصرف المركزي G - 250 في تركيزات منخفضة.
وباختصار ، فإن صيغة مريحة جدا ، وغير الخطرة نسبيا ، وصديقة للبيئة ورخيصة. وعلاوة على ذلك تلطيخ كانغ هي متوافقة تماما مع تحليل الطيفي الشامل. في النهاية يمكن القول أن كانغ Coomassie تلطيخ ممتازة في الكشف عن جل سريع والتحليلية للبروتينات حتى لنهج يستند البروتيوميات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدي أي شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر الدكتور نقولا Wiethölter لإعداد وتلون 1 مد المواد الهلامية.
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة مقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (GRK 1089/project 5 إلى ND وSM) وبدعم من منحة بحثية من Manchot يورغن شتيفتونغ لND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| staining dishes with lids | VWR international | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck & Co., Inc. | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
