Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

快速,灵敏的胶体考马斯亮G - 250染色蛋白聚丙烯酰胺凝胶

doi: 10.3791/1431 Published: August 3, 2009

Summary

该视频应普及胶体考马斯亮蓝G - 250染色协议,根据康

Abstract

考马斯亮蓝(CBB)是常用的SDS - PAGE分离蛋白的可视化,提供一个简单的染色程序和高定量的染料。此外,它是完全兼容与质谱蛋白质鉴定。但尽管有这些优势,CBB被认为是比银或荧光染色法和较不敏感,因此很少用于分析凝胶为基础的蛋白质组学方法检测蛋白质。

已作出了一些改进原来的考马斯协议 1增加CBB灵敏度。两个重大修改,以提高转换成胶体粒子的染料分子的低丰度蛋白质的检测:在1988年,Neuhoff和他的同事们应用到的CBB G - 250基于染色溶液2 20%甲醇和硫酸铵的浓度较高,和2004年Candiano等。建立了蓝银在硫酸铵和甲醇 3在场的CBB G - 250使用磷酸。然而,所有这些修改,只允许约10毫微克蛋白质的检测。一个广泛琐细的协议,胶体考马斯染色康有为等人在2002年发表了他们关于修改Neuhoff胶体CBB染色协议的络合物质。取而代之的硫酸铵,他们用硫酸铝和甲醇毒性较低的乙醇 4取代。的新型铝为基础的染色,在康有为的研究中表现出卓越的灵敏度,可检测低为1毫微克/乐队(磷酸二)与灵敏度变化不大,对蛋白质而定。

在这里,我们展示了康有为的快速和敏感的胶体考马斯亮蓝染色分析目的蛋白的协议的应用程序。我们将说明使用二维凝胶经常在我们的工作小组进行快速和容易的协议。

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

第1部分:二维(2 - D)凝胶电泳,用杯装

  1. IPG -带补液等电聚焦(IEF)
    • 在125μL补液盐补充水分Immobiline DryStrip凝胶,pH值6-11(7厘米)[7 M尿素,硫脲2米,4%CHAPS,50毫米hydroxyethyldisulfide和2%IPG缓冲液的pH值6-11]采用Immobiline DryStrip Reswelling托盘至少10小时。
    • 在IEF样品缓冲液溶解沉淀蛋白质样品[7 M尿素,硫脲2米,2%CHAPS,2%的ASB - 14,50 mM的hydroxyethyldisulfide和2%IPG缓冲液的pH值6-11]对应60-100微克每100μL蛋白。
    • 增溶(在室温下至少30分钟)后,申请通过阳极使用样品杯的杯装的蛋白质样品。杯的体积为100μL(集成块杯允许多达150μL)。
      注意:您可以负荷较大的样品量,如果你插入一个低电压的一步,在开始聚焦协议和笔芯的杯子,而仍然是一个有在杯子里的液体膜!
    • 进行等电聚焦Multiphor II电泳单位在梯度模式为11.1 KVH。
  2. 平衡和SDS - PAGE电泳
    • IEF后,IPG胶条受到还原和烷基化,每次15分钟,在摇床,平衡的解决方案中使用1%和2.5%二硫苏糖醇碘乙酰胺[50毫米Tris-HCl/pH 8.8,6​​ M尿素,30%甘油和2%SDS]。
    • 与H 2 O冲洗平衡条和印迹上的Whatman纸,以除去多余的的平衡缓冲液。之后浸在SDS运行缓冲液(1X)条。
    • 第二个方面是通过SDS - PAGE垂直电泳系统与总丙烯酰胺浓度为12%。平衡IPG胶条被放置在分离胶的顶部,并用热的琼脂糖溶液[0.5%琼脂糖凝胶电泳缓冲液含有溴酚蓝]固定。
    • 蛋白分离为2.5小时,在15分钟为120伏,直到染料前沿到达凝胶盒底部的80 V开始。

第2部分:胶体考马斯亮CBB G - 250染色

1。染色解决方案
注:染色解决方案的编制,使用分析纯(PA)和高纯度的水,如高品质的微孔系统(Milli - Q水 )的化学品。

考马斯亮解决方案: 公元2000毫升H 2 O
0.02%(W ​​/ V) CBB摹- 250 0,4克
5%(W / V) 硫酸铝(14-18)水合物 100克
10%(V / V) 乙醇(96%) 200毫升
2%(V / V) 正磷酸(85%) 47毫升

注:编制染色液的组成部分,按照下列顺序连续此外,要保持:

  1. 首先在Milli - Q水溶解硫酸铝
  2. 其后添加乙醇,均质,混合CBB G - 250解决方案
  3. 最近的解决方案是完全溶解后,加磷酸(酸掺入酒精媒体允许进入其胶体状态的考马斯分子聚合)
  4. 终于填补了Milli - Q水

注:最终的染色解决方案有一个黑暗的绿色,蓝色的外观和充满游泳周围的粒子:

  • 不要滤液这个解决方案!
  • 如果您更改编制的顺序,你会得到一个紫蓝色的解决方案,是较不敏感。
脱色的解决方案: 公元2000毫升H 2 O
10%(V / V) 乙醇(96%) 200毫升
2%(V / V) 正磷酸(85%) 47毫升

2。染色过程

  • 第二维分离后,小心取出凝胶玻璃板,他们转移到Milli - Q水填补了染色菜。
  • 凝胶洗净Milli - Q水水平摇床(洗衣机不足,导致敏感性差,因为SDS凝胶其余扰乱边界的蛋白质染料)10分钟三次。
  • 摇动考马斯亮解决方案,使用前均匀分散的胶体颗粒。
  • 孵育与考马斯亮解决方案覆盖上一个摇床搅拌2-12小时的凝胶。这染色产生的边际的背景,所以你可以观察到染色之间的进展。
    注:10分钟后,你可以看到第一个蛋白质点出现在2个小时的孵化内,约80 %,染色,。完成的最高水平。近100%,染色,孵育过夜建议。在某些情况下,当被染色的蛋白质的数量是巨大的和解决方案变成为一个明亮的蓝色,刷新染色解决方案是必要的。
  • 经过染色过程中删除的考马斯解决方案和Milli - Q水冲洗两次凝胶。
    注意:只要您可以重复使用的染色溶液颗粒尚存,否则丢弃(请记住,您的实验室可能有特殊规定的废物处置)。
  • 删除坚持与无棉绒纸巾染色菜的染料颗粒destain为10 - 60分钟。
    注意:您还可以洗Milli - Q水凝胶,但是这一点,我们只推荐用于制备凝胶,因为将有最后对凝胶,在扫描过程中会出现一个不规则的,弱的考马斯电影。
  • 最后Milli - Q水冲洗两次凝胶:凝胶将达到原来的厚度(酒精酸性介质中,使凝胶萎缩)和中和在水中此外增强考马斯的颜色强度。

第3部分:代表结果

如果按照上述协议,您将获得2 - D凝胶独特的解决和染深蓝色的蛋白质斑点。甚至比2 - D凝胶,银染根据舍甫琴科等 。5,良好的灵敏度和兼容性与质谱的协议,声称,我们实现平等的染色效果。

图1
图1:上述实验的最后结果。康有为的考马斯协议(一)执行强烈如银染, 舍甫琴科等 。(B)在检测后的2 - D凝胶电泳的蛋白质。

第4部分:技巧和窍门

  • 执行一些测试你自己的样品前处理染色法。无法解释的原因,我们有时一个感兴趣的蛋白质不能被检测到成功应用甚至当毫克。在这种情况下,我们建议准备一些系列稀释,检测灵敏度。
  • 如果你有低 - 凝胶检测的蛋白质(S)在一般情况下,堆放过程中的SDS - PAGE分离胶转移不成功的可能原因。您可以检查这些粘蛋白染色完整的凝胶,包括堆叠区。
  • 快速验证了您的等电聚焦结果,您可以直接染色IPG条,没有任何进一步的第二维分离。
  • 偶尔打开在染色过程中的凝胶,使他们双方染色均匀(如果你保持无动于衷凝胶,染料结合到凝胶的一面)。
  • 我们经验丰富的,存放在一个黑暗的瓶染色液的增加其生命周期(透明瓶至4月)。
  • 经过染色和记录,你可以保持几年的凝胶在冰箱中(如果您添加酸性溶液中避免由真菌污染)。
  • 脱色凝胶插头为胰蛋白酶消化,可以加速变暖块加热器。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

创新或只是另一种考马斯亮协议?

目前存在与考马斯亮蓝染色程序的多个协议。他们大多导致轻微或重大修改Neuhoff和同事2最常用的协议之一。康有为的协议的基础上Neuhoff的公式。但它真的蛋白质组学研究的一个替代的考马斯染色的方法吗?我们将图片的两个主要问题,检测限和可用性,证据表明,它绝对是一个有益的染色协议相比其他考马斯亮协议,甚至银色和荧光染色法。

焦点:检测限

在康有为的出版物,他们发现了几个标志蛋白1纳克/带(图2)。但是,在我们看来,一个4-8纳克/乐队的检测限为更可能与实践(见表1)。他们还讨论了有关卓越的灵敏度水平,胶体考马斯亮协议CBB在磷酸,硫酸铵,甲醇和酸性银染自Amersham Pharmacia公司生物技术(银染加套件)G - 250。

图2
图2:代表SDS凝胶,康有为等人发表。演示修改后的CBB - G250协议的权力。 250毫微克/乐队的蛋白质被装在最左侧和右侧连续稀释至2倍。

表1:从康有为的出版物相比,在一个更现实的阈值,蛋白质检测标准蛋白染色的限制。

蛋白质兆瓦[kDa的] 蛋白质的量[NG](虚拟对比严重)
肌球蛋白 220 1 / 4
B -半乳糖苷酶 116 1 / 4
磷酸化酶b 97 1 / 4
牛血清白蛋白 66 2 / 4
卵清蛋白 45 4 / 8

为了证实这些检测限制和以进一步验证康有为的染色方法,我们进行共同Laemmli分子重量市售像SYPRO红宝石 (BioRad公司)和深紫 (GE医疗)(图荧光染色解决方案检测标记SDS -凝胶我们自己的测试系列3)。有趣的是,康有为的染色分数,甚至更好地执行( 深紫 ),因此是绝对的劳动投入和性能方面的优越!

图3
图3:康有为的基于CBB - G250 -染色SYPRO红宝石 (B)和深紫 (GE医疗)(图3)(一)比较。 (三)在SDS - PAGE蛋白条带染色。分子量标记含有磷酸B(97.4 kDa的),牛血清白蛋白(66.2 kDa的),卵清蛋白(45 kDa的),碳酸酐酶(31 kDa)的,大豆胰蛋白酶抑制剂(21.5 kDa)的和溶菌酶(14.4 kDa的)进行了分析,蛋白质金额1克/乐队在左侧的凝胶和连续稀释2倍的权利。

然而,这些检测限测定标准蛋白分子量标记和使用应谨慎考虑。出于这个原因,我们另外测试康有为的染色方法与不同的蛋白质,部分有弱结合的亲和力CBB(如胎球蛋白,霉素)。图4表明,康有为的协议是优于传统CBB染色的,甚至比SYPRO Ruby的 ​​执行更好,但没有出现在这种情况下,银染。但是,我们认为康有为的修改后的染色方法是一个优秀的替代凝胶为基础的蛋白质组学的敏感和快速蛋白检测。

图4
图4:蛋白质的胎球蛋白染色(一)康有为的胶体考马斯亮协议(无脱色)相比,(二)传统的CBB摹- 250染色(40%甲醇和10%的醋酸),(三)SYPRO Ryby和(ð )银染舍甫琴科 。加载进行SDS - PAGE蛋白质2克,稀释高达2吴金额。

焦点二:可用性
除了完善的检测限值康有为的考马斯协议提供,它使对Neuhoff或Candiano染色法,甚至荧光协议优惠的几个特点:

  • 固定和染色一步完成
  • 不超过4个步骤
  • 第一染色结果快速可见的(在大多数情况下,不到20分钟内)
  • 程序需要完成80%的染色的只有2小时
  • 刚最小的背景染色
  • 染色过程是非常重现(这是一个终点法)
  • 没有更多的处理与有毒酒精(乙醇取代甲醇)
  • 解决的办法是几乎无臭(没有使用醋酸)
  • CBB G - 250在低浓度下使用。

综上所述,该公式是非常方便,相对无害,环境友好和廉价。此外,康氏染色是完全兼容的质谱分析。最后,可以说,康有为的考马斯染色甚至蛋白质组学为基础的方法快速分析蛋白质凝胶的检测是极好的。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

我没有透露。

Acknowledgments

我们感谢为准备和染色1 - D凝胶Nicola博士Wiethölter。

这项工作是由来自德意志研究联合会(GRK 1089/project 5 ND和SM)的资助,由来自于尔根Manchot的研究奖学金基金会于Nd支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Immobiline DryStrip gels GE Healthcare 17-6001-94 Can even be used 2 years after expire date.
Immobiline DryStrip Reswelling Tray GE Healthcare 80-6371-84 Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips.
Immobiline DryStrip Kit GE Healthcare 18-1004-30 Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups.
EPS 3501 XL Power Supply GE Healthcare 18-1130-05 Supplies voltage up to 3500 V.
Multiphor II Electrophoresis Unit GE Healthcare 18-1018-06 Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips)
PerfectBlue gel system Twin S Peqlab 45-1010-C SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system.
staining dishes with lids VWR international 216-3412 Fits for mini-gels. Stackable on shaker.
aluminium sulfate-18-hydrate Merck & Co., Inc. 1.01102.5000 We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package.
orthophosphoric acid Prolabo 20 624.295 Sold in glass bottles.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
  2. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
  3. Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
  4. Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
  5. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
快速,灵敏的胶体考马斯亮G - 250染色蛋白聚丙烯酰胺凝胶
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dyballa, N., Metzger, S. Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. J. Vis. Exp. (30), e1431, doi:10.3791/1431 (2009).More

Dyballa, N., Metzger, S. Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. J. Vis. Exp. (30), e1431, doi:10.3791/1431 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter