Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

doi: 10.3791/1431 Published: August 3, 2009

Summary

Deze video zal populariseren een colloïdale Coomassie G-250 kleuringsprotocol volgens Kang

Abstract

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is een kleurstof gebruikt voor de visualisatie van eiwitten gescheiden door SDS-PAGE, het aanbieden van een eenvoudige procedure kleuren en een hoge kwantificatie. Bovendien is het volledig compatibel met massaspectrometrische eiwit identificatie. Maar ondanks deze voordelen, is het CBB beschouwd worden minder gevoelig dan zilver of fluorescentie kleuringen en dus zelden gebruikt voor de detectie van proteïnen in de analytische gel op basis van proteomics benadering.

Diverse verbeteringen van de oorspronkelijke Coomassie protocol 1 zijn gedaan om de gevoeligheid van de CBB te verhogen. Twee belangrijke wijzigingen werden ingevoerd om de detectie van lage-overvloedige eiwitten te verbeteren door het omzetten van de kleurstof moleculen in colloïdale deeltjes: In 1988, Neuhoff en collega's toegepast 20% methanol en hogere concentraties van ammonium sulfaat in het CBB G 250-gebaseerde kleuroplossing 2, en in 2004 Candiano et al.. opgericht Blue Silver met behulp van CBB G-250 met fosforzuur in de aanwezigheid van ammoniumsulfaat en methanol 3. Toch zijn al deze aanpassingen maar laat een detectie van ongeveer 10 ng eiwit. Een breed fameless protocol voor het colloïdale Coomassie kleuring werd gepubliceerd door Kang et al.. In 2002, waar ze aangepaste colloïdaal CBB Neuhoff's kleuringsprotocol ten aanzien van de complexvormers stoffen. In plaats van ammoniumsulfaat ze gebruikt aluminiumsulfaat en methanol werd vervangen door de minder toxische ethanol 4. De nieuwe aluminium-gebaseerde vlekken in de studie van Kang's toonde superieure gevoeligheid die detecteert zo laag als 1 ng / band (fosforylase b) met weinig gevoeligheid variëren afhankelijk van eiwitten.

Hier tonen we de toepassing van het protocol Kang's voor een snelle en gevoelige colloïdale Coomassie kleuring van eiwitten in analytische doeleinden. We illustreren de snelle en gemakkelijke protocol met behulp van twee-dimensionale gels routinematig uitgevoerd in onze werkgroep.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deel 1: Twee-dimensionale (2-D) gelelektroforese met cup-loading

  1. IPG-strip rehydratie en iso-elektrische focussering (IEF)
    • Hydrateren Immobiline DryStrip gels, pH 6-11 (7 cm) in 125 ul rehydration solution [7 M ureum, 2 M thio, 4% CHAPS, 50 mM hydroxyethyldisulfide en 2% IPG Buffer pH 6-11] met behulp van Immobiline DryStrip Reswelling Lade voor ten minste 10 uur.
    • Los neergeslagen eiwitmonster in IEF monsterbuffer [7 M ureum, 2 M thio, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide en 2% IPG Buffer pH 6-11] die overeenkomt met 60-100 ug eiwit per 100 ul .
    • Na solubilisatie (ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur), van toepassing eiwitmonster via anodische cup-laden met sample cups. Het volume van de beker is 100 pi (Manifold bekers laten tot 150 pi).
      Opmerking: u kunt laden grotere steekproef in aanmerking nemen indien u een laagspannings-stap aan het begin van de focus protocol en vul de beker, terwijl er nog een vloeistof film in de beker!
    • Voer iso-elektrische focussering voor 11,1 KVH in de gradiënt-modus in de Multiphor II Electrophoresis Unit.
  2. Evenwicht en SDS-PAGE
    • Na het IEF, werden de IPG-strips onderworpen aan reductie en alkylering, elke keer 15 minuten op een shaker, met behulp van 1% en 2,5% dithiothreitol joodacetamide respectievelijk equilibratie oplossing [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M ureum, 30% glycerol en 2% SDS].
    • Spoel de geëquilibreerd strips met H 2 O en blot ze op Whatman papier om overtollig equilibratiebuffer te verwijderen. Daarna duik de strips in SDS-running buffer (1x).
    • Tweede dimensie is uitgevoerd door SDS-PAGE op een verticale elektroforese systemen met een totale acrylamide concentratie van 12%. Het evenwicht IPG-strips werden geplaatst op de top van de scheidende gels en vastgezet met hete agarose oplossing [0,5% agarose in rijklare buffer met broomfenolblauw].
    • Eiwitten zijn gescheiden voor 2,5 uur, te beginnen bij 80 V gedurende 15 minuten gevolgd door 120 V tot de kleurstof front bereikt de onderkant van de gel cassette.

Deel 2: Colloidal Coomassie kleuring met CBB G-250

1. Kleuroplossingen
Let op: voor de voorbereiding van de kleuring oplossingen, chemicaliën te gebruiken met een hoge kwaliteit, zoals pa (pa) en water van hoge zuiverheid als je van Millipore systemen (Milli-Q water).

Coomassie oplossing: ad 2000 ml H 2 O
0,02% (w / v) CBB G-250 0,4 g
5% (w / v) aluminiumsulfaat-(14-18)-hydraat 100 g
10% (v / v) ethanol (96%) 200 ml
2% (v / v) fosforzuur (85%) 47 ml

Let op: voor de voorbereiding van de kleuroplossing, de sequentiële toevoeging van de componenten in de volgende volgorde moet worden gehandhaafd:

  1. eerst opgelost aluminiumsulfaat in Milli-Q water
  2. daarna toe te voegen ethanol, homogeniseren, en mix CBB G-250 aan de oplossing
  3. zoals onlangs als de oplossing volledig is opgelost, voeg fosforzuur (de opname van het zuur aan de alcoholische media laat de Coomassie moleculen aggregaat in hun colloïdale toestand)
  4. eindelijk vullen met Milli-Q water

Let op: de uiteindelijke kleuroplossing heeft een donkere groen-blauwachtige uitstraling en is vol van deeltjes zwemmen rond:

  • Niet filtraat deze oplossing!
  • Als u de volgorde van voorbereiding, zou je een meer violet-blauw oplossing die minder gevoelig is.
Ontkleuroplossing: ad 2000 ml H 2 O
10% (v / v) ethanol (96%) 200 ml
2% (v / v) fosforzuur (85%) 47 ml

2. Kleuringsprocedure

  • Na de tweede dimensie scheiding, verwijder voorzichtig de gels uit de glasplaten en breng ze in een kleuring schaal gevuld met Milli-Q water.
  • Was de gels drie keer met Milli-Q water gedurende 10 minuten op een horizontale shaker (onvoldoende wassen veroorzaakt een slechte gevoeligheid omdat de resterende SDS op de gels verstoort het selectiekader van de kleurstof aan het eiwit).
  • Schud de Coomassie-oplossing voor gebruik gelijkmatig verspreiden van de colloïdale deeltjes.
  • Incubeer de gels goed bedekt met de Coomassie oplossing door roeren op een shaker voor 2-12 uur. Deze vlekken genereert marginale achtergrond, zodat u kunt zien de vlekken vooruitgang in tussen.
    Let op: na 10 minuten zie je eerste eiwit plekken verschijnen, binnen 2 uur incubatie ongeveer 80% vlekken tes maximale niveau is voltooid. Voor bijna 100% kleuring, wordt een nacht incubatie aanbevolen. In sommige gevallen, wanneer de hoeveelheid eiwit te worden gemerkt enorm is en de oplossing verandert in een helder blauw, een refresh van de kleuring oplossing nodig is.
  • Na de kleuringsprocedure verwijder de Coomassie-oplossing en spoel twee keer de gels met Milli-Q water.
    Opmerking: u kunt de kleuroplossing hergebruik, zolang deeltjes zijn nog steeds blijven, anders gooi hem (in gedachten houden dat uw laboratorium kan speciale regelgeving voor afvalverwijdering hebben).
  • Verwijder plakken kleurstof deeltjes uit de kleuring schotel met een niet-pluizende papieren handdoek en destain voor 10 - 60 minuten.
    Opmerking: U kunt ook de gels wassen alleen met Milli-Q water, maar we raden alleen voor preparatieve gels omdat er een onregelmatige, zwakke Coomassie film laatst op de gels die zullen ontstaan ​​tijdens het scannen procedure.
  • Tenslotte twee keer spoelen de gels met Milli-Q water: de gels hun oorspronkelijke dikte te bereiken (de alcohol-zuur media maakt de gels krimpen) en neutralisatie in het water bovendien verbetert Coomassie de kleur van intensiteit.

Deel 3: Representatieve resultaten

Als u de beschreven protocol hiervoor krijgt u op uw 2-D gel onderscheidende oplossing en goed gekleurd donkerblauw eiwit vlekken. Zelfs in vergelijking met een 2-D gel gekleurd met zilver volgens Shevchenko et al.. Vijf, een protocol beweert goede gevoeligheid en compatibiliteit met massaspectrometrie, bereiken we gelijk kleuringen.

Figuur 1
Figuur 1: uiteindelijke resultaat van het experiment zoals hierboven beschreven. Kang's Coomassie protocol (A) voert sterk als de zilverkleuring volgens Shevchenko et al.. (B) bij het ​​opsporen van eiwitten na 2-D gel elektroforese.

Deel 4: Tips en trucs

  • Doe een aantal testen kleuringen voor het verwerken van uw eigen monsters. Om onverklaarbare redenen meldden we wel eens dat een eiwit van belang niet met succes zou kunnen worden ontdekt, zelfs wanneer milligram werden toegepast. In dit geval raden wij u aan een aantal verdunningsreeks voor te bereiden om de gevoeligheid te testen.
  • Als u een lage in-gel detectie van eiwit (s) in het algemeen, mislukte transfer van het stapelen van de scheiding van gel tijdens de SDS-PAGE zal mogelijk de reden. U kunt controleren voor dergelijke plakkerige eiwitten door het kleuren van de volledige gel met inbegrip van het stapelen gebied.
  • Voor een snelle controle van uw iso-elektrische focussering resultaten, kunt u direct vlekken op de IPG-strips, zonder enige verdere tweede dimensie scheiding.
  • Af en toe draai de gels tijdens de kleuringsprocedure, zodat ze gelijkmatig in lood van beide kanten (als je de gels onbewogen, de kleurstof maar bindt zich aan een kant van de gel).
  • We ervaren dat de opslag van de kleuring oplossing in een donkere fles verhoogt de levensduur van de (in doorzichtige flessen tot 4 maanden).
  • Na kleuring en documenteren kunt u de gels te houden in de koelkast gedurende enkele jaren (als u toevoegt zure oplossing die u voorkomen dat besmettingen door schimmels).
  • Ontkleuroplossing gel pluggen voor een tryptische digest kan worden versneld door opwarming in een blok verwarming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Innovatieve of gewoon een andere Coomassie protocol?

Op dit moment bestaan ​​er verschillende protocollen voor kleuringen met Coomassie Brilliant Blue. De meesten van hen het gevolg zijn van kleine of grote wijzigingen van een van de meest gebruikte protocollen door Neuhoff en collega's 2. Ook Kang's protocol op basis van formule Neuhoff's. Maar is het echt een alternatief Coomassie kleuring methode voor proteomics onderzoek? We zullen foto twee belangrijke kwesties, detectielimiet en bruikbaarheid, aan te tonen dat het is zeker een nuttige kleuringsprotocol in vergelijking met andere Coomassie protocollen en zelfs zilver en tl-kleuringen.

Focus I: detectielimiet

In de publicatie Kang's, ze ontdekt verschillende markereiwitten tot 1 ng / band (figuur 2). Maar naar onze mening een detectielimiet van 4-8 ng / band is meer waarschijnlijk gerelateerd aan de praktijk (tabel 1). Zij verder superieure gevoeligheid niveaus in relatie besproken om zowel een colloïdale Coomassie protocol met CBB G-250 in fosforzuur, ammoniumsulfaat en methanol, en een zuur zilverkleuring (Silver Stain Plus Kit) van Amersham Pharmacia Biotechnology.

Figuur 2
Figuur 2: Representatieve SDS-gel gepubliceerd door Kang et al.. dat toont de kracht van de gewijzigde CBB-G250 protocol. 250 ng / band eiwitten werden geladen op de meest linker-en 2-voudig verdund aan de rechterkant achter elkaar.

Tabel 1: Kleuring grenzen voor standaard eiwitten uit de publicatie Kang's in vergelijking met een meer realistische drempelwaarde voor eiwit detectie.

Eiwit MW [kDa] Eiwitten zijn begrepen [ng] (virtuele versus ernstig)
myosin 220 1 / 4
b-galactosidase 116 1 / 4
fosforylase b 97 1 / 4
bovine serum albumine 66 2 / 4
ovalbumine 45 4 / 8

Ter bevestiging van deze detectiegrenzen en om verder te valideren Kang's kleuringsmethode we hebben onze eigen test-serie op gemeenschappelijke Laemmli SDS-gels met een moleculair gewicht markers gedetecteerd door commercieel beschikbare fluorescentiekleuring oplossingen zoals Sypro Ruby (BioRad) en Deep Purple (GE Healthcare) (figuur 3). Interessant, vlekken scoort Kang's goed of zelfs beter presteert (in geval van Deep Purple) en is dus zeker superieur in termen van arbeid en prestatie!

Figuur 3
Figuur 3: Vergelijking van Kang's CBB-G250-gebaseerde vlekken (A) met Sypro Ruby (B) en Deep Purple (GE Healthcare) (figuur 3). (C) kleuring van eiwitten bands in SDS-PAGE. Een moleculaire gewicht marker met fosforylase b (97.4 kDa), BSA (66.2 kDa), ovalbumine (45 kDa), koolzuuranhydrase (31 kDa), soja trypsine-remmer (21,5 kDa) en lysozym (14.4 kDa) werd geanalyseerd, met eiwit bedraagt van 1 g / band aan de linker zijde van de gel en achtereenvolgens verdund 2-voudig aan de rechterkant.

Toch werden deze detectielimieten bepaald met standaard eiwitten die gebruikt worden voor moleculair gewicht markers en moet worden beschouwd met de nodige voorzichtigheid. Om deze reden hebben we bovendien getest Kang's kleuringsmethode met verschillende eiwitten die gedeeltelijk zijn zwakke bindingsaffiniteit voor de CBB (bijv. fetuin, mycin). Zoals aangetoond in figuur 4, Kang's protocol is superieur aan de conventionele CBB vlekken en zelfs beter presteert dan Sypro Ruby, maar niet komen aan zilverkleuring in dit geval. Echter, wij geloven gewijzigd vlekken Kang's methode is een uitstekend alternatief voor de gevoelige en snelle eiwitten detecties in gel op basis van proteomics.

Figuur 4
Figuur 4: Eiwit kleuring van fetuin met (A) colloïdaal Coomassie protocol Kang's (zonder ontkleuren) in vergelijking met (B) een conventionele CBB G-250 kleuring (40% methanol en 10% azijnzuur), (C) Sypro Ryby en (D ) zilverkleuring volgens Shevchenko et al.. Eiwit hoeveelheden van 2 g verdund tot 2 ng werden geladen voor SDS-PAGE.

Focus II: usability
Naast de verbeterde detectie grenzen doet Kang's Coomassie protocol biedt verschillende functies die maakt het preferentiële richting van de kleuringen van Neuhoff of Candiano en zelfs fluorescentie protocollen:

  • bevestigings-en kleuring is gedaan in een stap
  • niet meer dan 4 stappen in alle
  • eerste kleuring resultaten zijn snel zichtbaar zijn (in de meeste gevallen in minder dan 20 minuten)
  • van de procedure vereist slechts twee uur voor 80% voltooiing van de kleuring
  • netminimale achtergrondkleuring
  • de kleuring procedure is zeer reproduceerbaar (het is een eindpunt methode)
  • niet meer omgaan met giftige alcohol (methanol, wordt vervangen door ethanol)
  • de oplossing is bijna reukloos (geen gebruik van azijnzuur)
  • het gebruik van CBB G-250 in lage concentraties.

Kortom, de formule is heel handig, relatief ongevaarlijk, milieuvriendelijk en goedkoop. Verder Kang's kleuring is volledig compatibel met massaspectrometrie analyses. Op het einde kan men zeggen dat Kang's Coomassie kleuring is uitstekend voor een snelle en analytische in-gel detectie van proteïnen, zelfs voor proteomics benaderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ik heb niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken dr. Nicola Wiethölter voor de voorbereiding en kleuring van een D-gels.

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 tot ND en SM) en ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Jürgen Manchot Stiftung te ND.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Immobiline DryStrip gels GE Healthcare 17-6001-94 Can even be used 2 years after expire date.
Immobiline DryStrip Reswelling Tray GE Healthcare 80-6371-84 Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips.
Immobiline DryStrip Kit GE Healthcare 18-1004-30 Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups.
EPS 3501 XL Power Supply GE Healthcare 18-1130-05 Supplies voltage up to 3500 V.
Multiphor II Electrophoresis Unit GE Healthcare 18-1018-06 Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips)
PerfectBlue gel system Twin S Peqlab 45-1010-C SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system.
staining dishes with lids VWR international 216-3412 Fits for mini-gels. Stackable on shaker.
aluminium sulfate-18-hydrate Merck & Co., Inc. 1.01102.5000 We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package.
orthophosphoric acid Prolabo 20 624.295 Sold in glass bottles.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
  2. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
  3. Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
  4. Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
  5. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dyballa, N., Metzger, S. Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. J. Vis. Exp. (30), e1431, doi:10.3791/1431 (2009).More

Dyballa, N., Metzger, S. Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. J. Vis. Exp. (30), e1431, doi:10.3791/1431 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter