Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide

Summary

Cette vidéo est de populariser une colloïdale Coomassie G-250 protocole de coloration en fonction de Kang

Abstract

Coomassie Brilliant Blue (CBB) est un colorant couramment utilisé pour la visualisation des protéines séparées par SDS-PAGE, offrant une procédure de coloration simple et quantification élevée. Par ailleurs, il est totalement compatible avec l'identification des protéines par spectrométrie de masse. Mais malgré ces avantages, CBB est considéré comme moins sensible que d'argent ou de colorations fluorescence et donc rarement utilisés pour la détection des protéines dans les approches protéomiques analytiques à base de gel.

Plusieurs améliorations de l'original du protocole ¹ de Coomassie ont été faits pour augmenter la sensibilité de la CBB. Deux modifications majeures ont été introduites pour améliorer la détection de protéines de faible abondance par la conversion des molécules de colorant dans les particules colloïdales: En 1988, Neuhoff et ses collègues ont utilisé 20% de méthanol et de plus fortes concentrations de sulfate d'ammonium dans le CBB G-250 une solution de coloration basée ^2, et en 2004, al Candiano et al. établie Blue Silver utilisant CBB G-250 avec de l'acide phosphorique en présence de sulfate d'ammonium et de méthanol ^3. Néanmoins, toutes ces modifications permettent simplement une détection d'environ 10 ng de protéines. Un protocole largement fameless pour Coomassie coloration colloïdale a été publié par Kang et al. En 2002 où ils ont modifié le protocole Neuhoff colloïdale coloration CBB concernant les substances complexantes. Au lieu de sulfate d'ammonium ils ont utilisé du sulfate d'aluminium et de méthanol a été remplacé par le ⁴ éthanol moins toxiques. La base d'aluminium dans l'étude de nouvelles taches de Kang a montré une sensibilité supérieure, qui détecte aussi bas que 1 ng / bande (phosphorylase b) avec une variation peu de sensibilité en fonction des protéines.

Ici, nous démontrons l'application du protocole de Kang rapide et sensible pour la coloration de Coomassie colloïdal de protéines à des fins analytiques. Nous allons illustrer le protocole rapide et facile en utilisant des gels bidimensionnels en routine dans notre groupe de travail.

Protocol

Partie 1: l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-D) à l'aide de la Coupe de chargement

1. IPG-bande de la réhydratation et la focalisation isoélectrique (IEF)
   • Réhydrater les gels DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) dans 125 ul solution de réhydratation [7 M urée, 2 M thiourée, CHAPS 4%, 50 mM hydroxyethyldisulfide et 2% IPG 6-11 pH Tampon] à partir du bac DryStrip Immobiline Reswelling pour au moins 10 heures.
   • Dissoudre l'échantillon de protéines précipités dans le tampon d'échantillon IEF [7 M urée, 2 M thiourée, CHAPS 2%, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide et 2% IPG 6-11 pH Tampon] correspondant à 60-100 pg de protéine par 100 ul .
   • Après solubilisation (au moins 30 minutes à température ambiante), appliquer échantillon de protéine par l'intermédiaire anodique tasse de chargement en utilisant des tasses échantillon. Le volume de la coupe est de 100 ul (tasses collecteur permettre jusqu'à 150 pl.)
     Remarque: vous pouvez charger des quantités plus grandes de l'échantillon si vous insérez une étape à basse tension au début du protocole de concentrer et de remplir les tasses pendant qu'il est encore un film de liquide dans la tasse!
   • Effectuer isoélectrofocalisation pour 11,1 KVH en mode dégradé dans l'unité d'électrophorèse Multiphor II.
2. Equilibration et SDS-PAGE
   • Après l'IEF, les bandes IPG ont été soumis à une réduction et d'alkylation, à chaque fois 15 minutes sur un agitateur, en utilisant le dithiothréitol 1% et 2,5% respectivement iodoacétamide dans une solution d'équilibration [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M d'urée, glycérol 30% et 2% de SDS].
   • Rincez les bandes équilibrée avec H ₂ O et les effacera sur papier Whatman pour enlever l'excès de tampon d'équilibration. Ensuite tremper les bandes en SDS-Tampon (1X).
   • La seconde dimension est réalisée par SDS-PAGE sur un système d'électrophorèse verticale avec une concentration d'acrylamide total de 12%. Les bandes IPG équilibrée ont été placés sur le haut de la séparation et des gels d'agarose fixe avec solution chaude [agarose à 0,5% dans la gestion de tampon contenant bleu de bromophénol].
   • Les protéines ont été séparées pendant 2,5 h, à partir de 80 V pendant 15 minutes suivie par 120 V jusqu'à ce que le front atteint le fond de la cassette de gel.

Partie 2: coloration de Coomassie colloïdal avec CBB G-250

1. Solutions de coloration
Remarque: pour la préparation des solutions de coloration, utiliser des produits chimiques de haute qualité tels que la qualité analytique (PA) et d'eau de grande pureté que vous obtenez à partir de systèmes Millipore (eau Milli-Q).

Solution de Coomassie:		ad 2000 ml H 2 O
0,02% (p / v)	CBB G-250	0,4 g
5% (p / v)	sulfate d'aluminium (14-18)-hydrate	100 g
10% (v / v)	l'éthanol (96%)	200 ml
2% (v / v)	l'acide orthophosphorique (85%)	47 ml

Remarque: pour la préparation de la solution de coloration, l'addition séquentielle des composants dans l'ordre suivant doit être maintenu:

1. première dissolution du sulfate d'aluminium en eau Milli-Q
2. puis ajouter de l'éthanol, homogénéiser et mélanger CBB G-250 à la solution
3. aussi récemment que la solution soit complètement dissoute, ajouter de l'acide phosphorique (l'incorporation de l'acide pour les médias alcoolisées permet de molécules Coomassie globale dans leur état colloïdal)
4. Enfin remplir avec eau Milli-Q

Remarque: la solution de coloration finale a une couleur vert foncé-bleu apparence et est plein de particules nageant autour:

• Ne pas filtrat cette solution!
• Si vous avez modifié l'ordre de préparation, vous obtiendrez une solution plus violet bleuté qui est moins sensible.

Décoloration solution:		ad 2000 ml H 2 O
10% (v / v)	l'éthanol (96%)	200 ml
2% (v / v)	l'acide orthophosphorique (85%)	47 ml

2. Procédure de coloration

• Après la séparation deuxième dimension, retirez soigneusement les gels des plaques de verre et de les transférer dans un plat rempli de taches eau Milli-Q.
• Lavez les gels à trois reprises avec eau Milli-Q pendant 10 minutes sur un agitateur horizontal (lavage insuffisant entraîne une mauvaise sensibilité parce que le reste sur les gels SDS perturbe la délimitation de la teinture à la protéine).
• Agiter la solution avant de l'utiliser de Coomassie pour disperser les particules colloïdales uniformément.
• Incuber les gels bien couvert avec la solution de Coomassie par l'agitation sur un agitateur pour 2-12 heures. Cette coloration de fond génère marginale sorte que vous pouvez observer la progression coloration entre les deux.
  Remarque: après 10 minutes, vous pouvez voir des taches de protéines première apparition, dans les 2 heures d'incubation d'environ 80% de coloration pour elleniveau maximum s est terminée. Depuis près de 100% coloration, une nuit d'incubation est recommandée. Dans certains cas, lorsque la quantité de protéines à teindre est énorme et la solution se transforme en un bleu vif, un rafraîchissement de la solution de coloration est nécessaire.
• Après la procédure de coloration éliminer la solution de Coomassie et rincer deux fois avec les gels eau Milli-Q.
  Remarque: vous pouvez réutiliser la solution de coloration aussi longtemps que les particules sont encore en suspens, sinon jetez-le (n'oubliez pas que votre laboratoire peut avoir des règlements spéciaux pour l'élimination des déchets).
• Retirer coller des particules de colorant de l'antenne avec une coloration non pelucheux serviette en papier et Décolorer pendant 10 - 60 minutes.
  Note: Vous pouvez aussi laver les gels juste avec eau Milli-Q, mais cela nous recommandons que pour la chromatographie préparative gels car il y aura une dernière irrégulière, film faibles Coomassie sur les gels qui se poseront pendant la procédure de numérisation.
• Enfin rincez les gels à deux reprises avec eau Milli-Q: les gels atteindront leur épaisseur d'origine (les médias l'alcool-acide fait du rétrécissement des gels) et de neutralisation dans l'eau augmente l'intensité des couleurs de plus de Coomassie.

Partie 3: Les résultats représentatifs

Si vous suivez le protocole décrit ci-dessus, vous obtiendrez sur votre 2-D de gel distinctifs résolus et bien teinté foncé spots protéiques bleu. Même par rapport à un gel 2-D taché avec de l'argent en fonction de Shevchenko et al. ^5, un protocole affirmant une bonne sensibilité et une compatibilité avec la spectrométrie de masse, nous obtenons des résultats coloration égale.

Figure 1: Résultat final de l'expérimentation décrite ci-dessus. Kang Coomassie protocole (A) effectue vivement, comme la coloration d'argent conformément à Shevchenko et al. (B) dans la détection des protéines après 2-D électrophorèse sur gel.

Partie 4: Trucs et astuces

• Effectuez quelques colorations test avant le traitement vos propres échantillons. Pour des raisons inexplicables, nous avons signalé que, parfois une protéine d'intérêt ne pouvait pas être détecté avec succès, même lorsque milligrammes ont été appliquées. Dans ce cas nous vous conseillons de préparer quelques séries de dilution de tester la sensibilité.
• Si vous avez peu de gel de détection de la protéine (s) en général, le transfert échoue de l'empilement au gel de séparation au cours de SDS-PAGE sera peut-être la raison. Vous pouvez vérifier ces protéines collantes par coloration du gel complet incluant la zone d'empilage.
• Pour une vérification rapide de vos résultats axés isoélectrique, vous pouvez directement tacher les bandes IPG-sans aucune séparation seconde dimension supplémentaire.
• Parfois leur tour, les gels pendant la procédure de coloration afin qu'ils soient uniformément teinté des deux côtés (si vous gardez les gels impassible, le colorant se lie à un seul côté du gel).
• Nous avons connu que le stockage de la solution de coloration dans une bouteille sombre augmente sa durée de vie (dans des bouteilles transparentes jusqu'à 4 mois).
• Après coloration et la documentation que vous pouvez garder les gels dans le réfrigérateur pendant plusieurs années (si vous ajoutez une solution acide, vous éviter les contaminations par des champignons).
• Décoloration de bouchons de gel pour une digestion trypsique peut être accéléré par le réchauffement dans un chauffe-bloc.

Discussion

Innovants ou tout simplement un autre protocole de Coomassie?

À l'heure actuelle, il existe plusieurs protocoles pour les procédures de coloration de Coomassie Brilliant Blue. La plupart d'entre eux résultent de modifications mineures ou majeures de l'un des protocoles les plus couramment utilisés par les Neuhoff et ses collègues ^2. Aussi le protocole Kang est basé sur la formule de Neuhoff. Mais est-ce vraiment une méthode de coloration au bleu de Coomassie alternatives pour la recherche en protéomique? Nous allons d'image deux questions principales, limite de détection et de la convivialité, à la preuve que c'est certainement un protocole de coloration bénéfique par rapport à d'autres protocoles de Coomassie et colorations, même l'argent et fluorescentes.

Focus I: limite de détection

Lors de la publication de Kang, ils ont détecté plusieurs protéines marqueurs jusqu'à 1 ng / bande (figure 2). Mais à notre avis une limite de détection de 4-8 ng / bande est plus probablement liée à la pratique (tableau 1). Ils ont en outre discuté des niveaux de sensibilité supérieure par rapport à la fois un protocole de Coomassie colloïdal avec CBB G-250 dans l'acide phosphorique, sulfate d'ammonium et du méthanol, et une coloration à l'argent acide (coloration à l'argent plus Kit) de Amersham Pharmacia Biotechnology.

Figure 2: Représentant gel SDS publié par Kang et al. qui démontre la puissance de la modification du CBB-G250 protocole. 250 ng / bande protéines ont été chargées à l'extrême gauche et 2 fois dilué à la droite consécutivement.

Tableau 1: Coloration des limites pour les protéines de la norme prise de la publication de Kang en comparaison à un seuil plus réaliste pour la détection des protéines.

Protéines	MW [kDa]	Quantité de protéine [ng] (virtuelle vs grave)
myosine	220	1 / 4
b-galactosidase	116	1 / 4
phosphorylase b	97	1 / 4
l'albumine sérique bovine	66	2 / 4
ovalbumine	45	4 / 8

Pour confirmer ces limites de détection et de valider davantage la méthode de coloration de Kang nous avons effectué notre série de test propre commune Laemmli SDS-gels avec des marqueurs de poids moléculaire détectée par commercialement disponible solutions de coloration fluorescente, comme Sypro Ruby (BioRad) et Deep Purple (GE Healthcare) (figure 3). Fait intéressant, les scores coloration Kang bien ou même plus performant (en cas de Deep Purple) et est donc nettement supérieure en termes de facteur travail et la performance!

Figure 3: Comparaison de Kang-CBB G250 basée coloration (A) avec Sypro Ruby (B) et Deep Purple (GE Healthcare) (figure 3). (C) la coloration des bandes de protéines en SDS-PAGE. Un marqueur de poids moléculaire contenant phosphorylase b (97,4 kDa), BSA (66,2 kDa), l'ovalbumine (45 kDa), l'anhydrase carbonique (31 kDa), inhibiteur de trypsine de soja (21,5 kDa) et le lysozyme (14,4 kDa) a été analysée, avec des quantités de protéines de 1 g / bande sur le côté gauche du gel et consécutivement dilué 2 fois à droite.

Néanmoins, ces limites de détection ont été déterminés avec des protéines standard utilisé pour les marqueurs de poids moléculaire et doivent être considérés avec prudence. Pour cette raison, nous avons également testé la méthode de coloration de Kang avec des protéines différentes qui ont en partie la faiblesse affinité de liaison pour CBB (par exemple la fétuine, mycine). Comme l'a montré dans la figure 4, le protocole de Kang est supérieure à la coloration CBB conventionnelle et exécute encore mieux que Sypro Ruby, mais ne vient pas jusqu'à coloration à l'argent dans ce cas. Cependant, nous croyons méthode de Kang coloration modifiée est une excellente alternative pour les détections de protéines sensibles et rapides dans le gel à base protéomique.

Figure 4: Coloration des protéines de la fétuine avec (A) de Kang Coomassie protocole colloïdale (sans décoloration) par rapport à (B) une conventionnelles CBB G-250 coloration (40% de méthanol et 10% d'acide acétique), (C) Sypro Ryby et (D coloration à l'argent) en fonction de Shevchenko et al. Quantités de protéines de 2 g dilué jusqu'à 2 ng ont été chargés pour SDS-PAGE.

Focus II: la convivialité
Outre les limites de détection améliorées ne Kang Coomassie protocole offre plusieurs fonctionnalités qui le rend préférentielle vers les colorations de Neuhoff ou Candiano et des protocoles, même fluorescence:

• fixation et coloration est faite en une seule étape
• pas plus de 4 étapes dans tous les
• résultats de coloration premiers sont rapidement visibles (dans la plupart des cas en moins de 20 minutes)
• la procédure ne nécessite que 2 heures pour 80% d'achèvement de la coloration
• simplementcoloration de fond minimal
• la procédure de coloration est très reproductible (il s'agit d'une méthode de point final)
• pas plus de manipulation avec de l'alcool toxique (méthanol est remplacé par l'éthanol)
• la solution est presque inodore (pas d'utilisation de l'acide acétique)
• l'utilisation de CBB G-250 en faibles concentrations.

En résumé, la formule est très pratique, relativement non dangereux, à l'environnement convivial et bon marché. Par ailleurs coloration Kang est entièrement compatible avec les analyses par spectrométrie de masse. En fin de compte, on peut dire que la coloration de Kang Coomassie est excellent pour un rapide et d'analyse en gel de détection des protéines, même pour des approches de protéomique basée.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immobiline DryStrip gels	GE Healthcare	17-6001-94	Can even be used 2 years after expire date.
Immobiline DryStrip Reswelling Tray	GE Healthcare	80-6371-84	Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips.
Immobiline DryStrip Kit	GE Healthcare	18-1004-30	Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups.
EPS 3501 XL Power Supply	GE Healthcare	18-1130-05	Supplies voltage up to 3500 V.
Multiphor II Electrophoresis Unit	GE Healthcare	18-1018-06	Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips)
PerfectBlue gel system Twin S	Peqlab	45-1010-C	SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system.
staining dishes with lids	VWR international	216-3412	Fits for mini-gels. Stackable on shaker.
aluminium sulfate-18-hydrate	Merck & Co., Inc.	1.01102.5000	We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package.
orthophosphoric acid	Prolabo	20 624.295	Sold in glass bottles.