Summary
וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג
Abstract
Coomassie מבריק כחול (CBB) הוא צבע נפוץ עבור להדמיה של חלבונים מופרדים על ידי SDS-PAGE, המציע הליך מכתים פשוט quantitation גבוהה. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם הזדהות המונית חלבון spectrometric. אך למרות יתרונות אלה, CBB נחשב להיות רגישים פחות כסף או stainings הקרינה ולכן רק לעתים נדירות נעשה שימוש לצורך זיהוי של חלבונים הג'ל מבוסס גישות אנליטיות proteomic.
שיפורים אחדים המקורי Coomassie פרוטוקול 1 נעשו כדי להגדיל את הרגישות של CBB. שני השינויים העיקריים שהוכנסו על מנת לשפר את הזיהוי של נמוכה שפע חלבונים ידי המרת מולקולות צבען לחלקיקים colloidal: בשנת 1988 חל נייהוף ועמיתיו מתנול 20% ו ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט לתוך פתרון ה-G-250 מכתים CBB מבוסס 2, ובשנת 2004 Candiano et al. הוקמה כסף כחול באמצעות CBB G-250 עם חומצה זרחתית בנוכחות סולפאט אמוניום, מתנול 3. עם זאת, כל השינויים האלה רק לאפשר זיהוי של חלבון כ 10 ננוגרם. פרוטוקול fameless נרחב מכתים Coomassie colloidal פורסם על ידי קאנג et al. בשנת 2002 שונה שם הם מכתים פרוטוקול colloidal של נייהוף CBB לגבי חומרים complexing. במקום אמוניום סולפט הם השתמשו סולפט אלומיניום מתנול הוחלף 4 אתנול פחות רעיל. אלומיניום מבוסס הרומן מכתים במחקר של קאנג הראו רגישות מעולה שמזהה נמוך כמו 1 ng / להקה (phosphorylase ב) עם וריאציה קצת רגישות בהתאם חלבונים.
הנה, אנחנו מדגימים יישום פרוטוקול של קאנג עבור מכתים מהיר ורגיש Coomassie colloidal של חלבונים למטרות אנליטיות. נדגים את פרוטוקול מהירה וקלה באמצעות דו מימדי ג'לים ביצע באופן שגרתי בקבוצת העבודה שלנו.
Protocol
חלק 1: דו מימדי (2-D) ג'ל אלקטרופורזה באמצעות כוס העמסה
- IPG-רצועת התייבשות ומיקוד isoelectric (IEF)
- רעננותם ג'לים Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 ס"מ) בתמיסה 125 התייבשות μl [7 M אוריאה, 2 M thiourea, בחורים 4%, 50 hydroxyethyldisulfide מ"מ 2% IPG pH הצפת 6-11] באמצעות מגש DryStrip Immobiline Reswelling עבור לפחות 10 שעות.
- ממיסים מדגם חלבון זירז במאגר מדגם IEF [7 M אוריאה, 2 M thiourea, בחורים 2%, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide מ"מ 2% IPG pH הצפת 6-11] המקביל לחלבון 60-100 מיקרוגרם לכל 100 μl .
- לאחר solubilization (לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר), להחיל מדגם חלבון באמצעות anodic כוס טעינה באמצעות כוסות המדגם. נפח כוס הוא 100 μl (כוסות סעפת לאפשר עד μl 150).
הערה: אתה יכול לטעון כמויות מדגם גדול יותר אם תוסיף צעד מתח נמוך בתחילת פרוטוקול התמקדות ולמלא את הכוסות כל עוד יש סרט הנוזל בכוס! - בצע isoelectric התמקדות עבור קו"ה 11.1 במצב שיפוע ביחידה אלקטרופורזה Multiphor השנייה.
- איזון ו SDS-PAGE
- לאחר IEF, רצועות IPG היו נתונים הפחתת אלקילציה, בכל פעם 15 דקות על שייקר, באמצעות dithiothreitol 1% ו 2.5% בהתאמה iodoacetamide בפתרון איזון [50 מ"מ Tris-HCl/pH 8.8, 6 M אוריאה, גליצרול 30% ו -2% SDS].
- שוטפים את רצועות equilibrated עם H 2 O ו - כתם אותם על גבי נייר whatman להסיר חיץ איזון עודף. לאחר מכן טובלים את רצועות חיץ SDS ריצה (1X).
- הממד השני מבוצע על ידי SDS-PAGE על מערכות אלקטרופורזה אנכי עם ריכוז acrylamide סך של 12%. רצועות IPG equilibrated הונחו על החלק העליון של ג'לים להפריד קבוע עם פתרון agarose חם [agarose 0.5% בניהול מאגר המכיל כחול bromophenol].
- החלבונים הופרדו עבור 2.5 שעות, החל מהשעה V 80 ל -15 דקות ואחריו V 120 עד הכניסה לצבוע מגיע התחתון של הקלטת ג'ל.
חלק 2: Colloidal מכתים Coomassie עם CBB G-250
1. מכתים פתרונות
הערה: להכנת הפתרונות מכתים, להשתמש בחומרים כימיים עם איכות גבוהה כגון כיתה אנליטית (רש"פ) ומים של טוהר גבוה ככל שאתה מקבל Millipore מערכות (מילי-Q מים).
| Coomassie פתרון: | מודעה 2000 מ"ל H 2 O | |
| 0.02% (w / v) | CBB G-250 | 0,4 גרם |
| 5% (w / v) | אלומיניום סולפט (14-18), מימה | 100 גרם |
| 10% (V / V) | אתנול (96%) | 200 מ"ל |
| 2% (V / V) | orthophosphoric חומצה (85%) | 47 מ"ל |
הערה: להכנת הפתרון מכתים, הוספת רציפים המרכיבים לפי הסדר הבא חייב להישמר:
- first לפזר סולפט אלומיניום במים מילי-Q
- לאחר מכן להוסיף אתנול, homogenize, ומערבבים CBB G-250 לפתרון
- כפי לאחרונה כמו הפתרון הוא נמס לגמרי, מוסיפים חומצה זרחתית (שילוב של חומצה לתקשורת אלכוהוליים מאפשר מולקולות Coomassie המצרפי למצב colloidal שלהם)
- סוף סוף להתמלא מים מילי-Q
הערה: הפתרון הסופי מכתים יש מראה כהה ירוק כחלחל מלא חלקיקים שחייה סביב:
- אל תסנין פתרון זה!
- אם שינית את סדר ההכנה, היית מקבל פתרון יותר סגול כחלחל כי הוא רגיש פחות.
| Destaining פתרון: | מודעה 2000 מ"ל H 2 O | |
| 10% (V / V) | אתנול (96%) | 200 מ"ל |
| 2% (V / V) | orthophosphoric חומצה (85%) | 47 מ"ל |
2. מכתים נוהל
- לאחר ההפרדה המימד השני, בזהירות להסיר את הג'לים של לוחות זכוכית ולהעביר אותם לתוך צלחת מכתים מלא מים מילי-Q.
- שטפו את הג'לים שלוש פעמים במים מילי-Q במשך 10 דקות על שייקר האופקי (שטיפה לא מספקת גורמת רגישות העניים כי SDS הנותרים על הג'לים מפריעה התוחמת של הצבע לחלבון).
- Shake הפתרון Coomassie לפני השימוש כדי לפזר את חלקיקי colloidal שווה.
- דגירה ג'לים מכוסה היטב על ידי תסיסה על שייקר עם פתרון Coomassie במשך 2-12 שעות. מכתים זה יוצר רקע שולית, כך שתוכל לבחון את התקדמות מכתים שביניהם.
הערה: לאחר 10 דקות ניתן לראות כתמי חלבון הראשון המופיע בתוך 2 שעות הדגירה כ 80% מכתים את זהרמה מקסימלית של הושלמה. עבור מכתים כמעט 100%, הדגירה לילה מומלץ. במקרים מסוימים, כאשר כמות החלבון להיות מוכתם הוא עצום פתרון הופך כחול בהיר, רענון של הפתרון מכתים הכרחי. - לאחר ההליך מכתים להסיר את הפתרון Coomassie ולשטוף את הג'לים פעמיים עם מים מילי-Q.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר פתרון מכתים עוד חלקיקים עדיין הנותרים, אחרת לבטל את זה (יש לזכור כי במעבדה שלך יכול להיות תקנות מיוחדות עבור סילוק פסולת). - הסרת דבק חלקיקי צבע מצלחת מכתים במגבת-מוך חופשי נייר destain עבור 10 - 60 דקות.
הערה: ניתן גם לשטוף את הג'לים רק עם מים מילי-Q אבל זה מומלץ רק עבור preparative ג'לים כי תימשך לא סדיר, חלש הסרט Coomassie על ג'לים שתקום במהלך הליך הסריקה. - לבסוף לשטוף את הג'לים פעמיים עם מים מילי-Q: ג'לים יגיע עובי המקורי שלהם (את האלכוהול חומצה התקשורת עושה את התכווצות ג'לים) ו נטרול במים בנוסף משפר את עוצמת הצבע של Coomassie.
חלק 3: תוצאות נציג
אם אתה מבין את הפרוטוקול המתואר לעיל תקבל על 2-D שלך הייחודי ג'ל נקודות נפתרה גם מוכתם כחול כהה חלבון. אפילו בהשוואה ג'ל 2-D מוכתם כסף לפי שבצ'נקו et al. 5, פרוטוקול בטענה רגישות תאימות טובה עם ספקטרומטריית מסה, אנחנו משיגים תוצאות מכתים שווים.
איור 1: התוצאה הסופית של הניסויים שתוארו לעיל. Coomassie קאנג של פרוטוקול (א) מבצע חזק כמו מכתים את הכסף על פי שבצ'נקו et al. (ב) באיתור חלבונים לאחר אלקטרופורזה 2 D-ג'ל.
חלק 4: טיפים וטריקים
- בצעו כמה stainings בדיקה לפני עיבוד דגימות משלך. מסיבות בלתי מוסברים דיווחנו כי לפעמים חלבון של עניין לא ניתן היה לזהות בהצלחה גם כאשר מיליגרם יושמו. במקרה זה אנו ממליצים להכין כמה סדרות דילול כדי לבדוק רגישות.
- אם יש לך נמוך ג'ל זיהוי של חלבון (ים) העברה, בכלל לא מוצלח מן הערמה על ג'ל המפריד במהלך SDS-PAGE יהיה להיות הסיבה. אתה יכול לבדוק חלבונים דביק כזה על ידי מכתים את הג'ל מלא כולל באזור הערמה.
- עבור אימות מהיר של תוצאות isoelectric שלך התמקדות, אתה יכול ישירות הכתם IPG, רצועות ללא הפרדה ממד נוסף בכל שנייה.
- מדי פעם להפוך את ג'לים במהלך ההליך מכתים ולכן הם מוכתמים באופן שווה משני הצדדים (אם אתה שומר הג'לים מתרגשים, לצבוע רק נקשר בצד אחד של הג'ל).
- חווינו את זה אחסון של הפתרון מכתים בבקבוק כהה מגביר את חייה (בבקבוקים שקופים עד חודש 4).
- לאחר מכתים ותיעוד אתה יכול לשמור את ג'ל במקרר במשך כמה שנים (אם תוסיף פתרון חומצי לך למנוע זיהומים על ידי פטריות).
- Destaining של אטמי ג'ל למשך לעכל tryptic יכול להיות מואץ על ידי חימום בתנור אבן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חדשני או רק עוד פרוטוקול Coomassie?
כרגע קיימים פרוטוקולים מרובים עבור מכתים נהלים Coomassie כחול מבריק. רובם תוצאה של שינויים קלים או גדולים של אחד הפרוטוקולים הנפוצים ביותר על ידי נייהוף ועמיתיו 2. כמו כן, פרוטוקול של קאנג מבוסס על נוסחה של נייהוף. אבל האם זה באמת שיטה חלופית מכתים Coomassie למחקר proteomic? אנו התמונה בשני נושאים עיקריים, גבול הגילוי ושימושיות, על ראיות כי זה בהחלט פרוטוקול מכתים מועיל לעומת פרוטוקולים אחרים Coomassie ו stainings כסף אפילו פלורסנט.
פוקוס אני: גבול הגילוי
בפרסום של קאנג, הם גילו כמה חלבונים סמן עד 1 ng / להקה (איור 2). אבל לדעתנו מגבלת זיהוי של 4-8 ng / להקה קשורה יותר סביר בפועל (לוח 1). עוד הם דנו רמות רגישות מעולה ביחס הן colloidal Coomassie פרוטוקול עם CBB G-250 של חומצה זרחתית, אמוניום סולפט, מתנול, וכן מכתים כסף חומצי (כסף קיט כתמים פלוס) מ ביוטכנולוגיה Pharmacia Amersham.
איור 2: נציג SDS ג'ל בהוצאת קאנג et al. זה ממחיש את העוצמה של פרוטוקול CBB-G250 שונה. 250 ng / להקה חלבונים הועמסו בקצה השמאלי ביותר של פי 2 בדילול מלא לצד ימין ברציפות.
טבלה 1: מכתים גבולות חלבונים תקן שנלקחו פרסום של קאנג בהשוואה סף מציאותית יותר לגילוי חלבון.
| חלבון | MW [kDa] | כמות חלבון [נ"ג] (וירטואלית מול רציני) |
| שרירן | 220 | 1 / 4 |
| ב-galactosidase | 116 | 1 / 4 |
| phosphorylase ב | 97 | 1 / 4 |
| שור בסרום אלבומין | 66 | 2 / 4 |
| ovalbumin | 45 | 4 / 8 |
כדי לאשר את המגבלות הללו איתור נוספת לאמת שיטת צביעה של קאנג ביצענו סדרה הבדיקה שלנו על המשותף Laemmli SDS-ג'לים עם סמנים משקל מולקולרי זוהה על ידי זמינים מסחרית פתרונות מכתים ניאון כמו Sypro רובי (BioRad) ו דיפ פרפל (GE Healthcare) (דמות 3). מעניין, ציונים מכתים של קאנג טוב או אפילו ביצועים טובים יותר (במקרה של דיפ פרפל) ולכן הוא בהחלט מעולה מבחינת תשומת העבודה והביצועים!
איור 3: השוואה בין הכתמה של קאנג CBB-G250 מבוססי (A) עם Sypro רובי (B) דיפ פרפל (GE Healthcare) (איור 3). (ג) מכתים של להקות חלבון SDS-PAGE. סמן משקל מולקולרי הכולל phosphorylase ב (97.4 KDA), ארגון ה-BSA (66.2 KDA), ovalbumin (45 KDA), anhydrase פחמתית (31 KDA), מעכבי טריפסין סויה (21.5 KDA) ו ליזוזים (14.4 KDA) נותח, עם כמויות חלבון של 1 גרם / להקה בצד השמאלי של הג'ל ומדולל ברציפות פי 2 ימינה.
עם זאת, מגבלות אלה נקבעו עם גילוי חלבונים הסטנדרטית המשמשת עבור סמנים משקל מולקולרי יש לשקול בזהירות. מסיבה זו, אנו בנוסף נבדק שיטת צביעה של קאנג עם חלבונים שונים אשר בחלקם יש זיקה מחייבת חלש עבור CBB (למשל fetuin, mycin). כפי שמודגם באיור 4, פרוטוקול של קאנג עדיפה מכתים את CBB קונבנציונאלי ואף מבצעת טוב יותר מאשר Sypro רובי, אבל לא בא עד מכתים כסף במקרה הזה. עם זאת, אנו מאמינים כי שינוי של קאנג שיטת צביעה היא חלופה יוצאת דופן עבור לתגליות חלבון רגיש במהירות הג'ל מבוסס proteomics.
איור 4: מכתים חלבון של fetuin עם (א) פרוטוקול colloidal Coomassie של קאנג (ללא destaining) לעומת (ב) קונבנציונלית CBB G-250 מכתים (40 מתנול% ו חומצה אצטית 10%), (ג) Sypro Ryby ו (ד ) כסף מכתים לפי שבצ'נקו et al. כמויות חלבון של 2 גרם מדולל עד נ"ג 2 הועמסו על עמוד SDS.
פוקוס II: שימושיות
לצד מגבלות זיהוי משופרת עושה Coomassie קאנג של פרוטוקול להציע מספר תכונות עושה את זה מועדף כלפי stainings של נייהוף או Candiano ופרוטוקולים הקרינה גם:
- תיקון ו מכתים נעשית בצעד אחד
- לא יותר מ 4 שלבים בכל
- תוצאות מכתים הראשונים הם גלויים מהיר (ברוב המקרים תוך פחות מ 20 דקות)
- ההליך דורש רק 2 שעות להשלמת 80% מכתים
- רקרקע מינימלי מכתים
- הוא מכתים את ההליך לשחזור מאוד (זוהי שיטת נקודות קצה)
- אין טיפול יותר עם אלכוהול רעילים (מתאנול הוא הוחלף על ידי אתנול)
- הפתרון הוא כמעט חסר ריח (אין טעם של חומצה אצטית)
- השימוש CBB G-250 בריכוזים נמוכים.
לסיכום, הנוסחה היא נוחה למדי, nonhazardous יחסית, ידידותי לסביבה וזול. יתר על כן מכתים של קאנג הוא תואם לחלוטין עם מנתח ספקטרומטריית מסה. בסופו של דבר ניתן לומר כי Coomassie של קאנג מכתים מצוין לגילוי ב-ג'ל מהיר אנליטית של חלבונים אפילו גישות proteomics מבוסס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ניקולה Wiethölter עבור הכנת מכתים של 1-D ג'לים.
עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם דויטשה Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 ל ND ו - SM) ונתמך על ידי מענק מחקר מן Manchot יורגן Stiftung ל ND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| staining dishes with lids | VWR international | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck & Co., Inc. | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
