Summary
Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda Kang
Abstract
Coomassie Brilliant Blue (CBB) è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione di proteine separate mediante SDS-PAGE, offrendo una procedura semplice colorazione e quantificazione alto. Inoltre, è completamente compatibile con l'identificazione delle proteine spettrometria di massa. Ma nonostante questi vantaggi, CBB è considerato essere meno sensibile di colorazioni argento o fluorescenza e quindi raramente utilizzato per la rilevazione di proteine in gel analitici approcci basati sulla proteomica.
Diversi miglioramenti del protocollo originale Coomassie 1 sono stati fatti per aumentare la sensibilità della CBB. Due importanti modifiche sono state introdotte per migliorare la rilevazione di proteine a bassa abbondanza convertendo le molecole di colorante in particelle colloidali: Nel 1988, Neuhoff e colleghi hanno applicato il 20% metanolo e concentrazioni più elevate di solfato di ammonio nel G-250 CBB soluzione colorante a base 2, e nel 2004 Candiano et al. stabilito Blue Silver con CBB G-250 con acido fosforico in presenza di solfato di ammonio e metanolo 3. Tuttavia, tutte queste modifiche solo permettono una rilevazione di circa 10 proteine ng. Un protocollo ampiamente fameless per la colorazione Coomassie colloidale è stato pubblicato da Kang et al. Nel 2002 dove si è modificato Neuhoff colloidale protocollo di colorazione CBB per quanto riguarda le sostanze complessanti. Invece di solfato di ammonio hanno usato solfato di alluminio e il metanolo è stato sostituito dal 4 etanolo meno tossici. Il romanzo a base di alluminio colorazione in studio Kang ha dimostrato una sensibilità superiore che rileva fino a 1 ng / banda (fosforilasi b) con variazione scarsa sensibilità in funzione delle proteine.
In questo studio dimostriamo applicazione del protocollo di Kang per una rapida e sensibile colorazione Coomassie colloidale di proteine per scopi di analisi. Ci illustrerà il protocollo veloce e semplice utilizzando bidimensionali gel eseguita di routine nel nostro gruppo di lavoro.
Protocol
Parte 1: bidimensionale (2-D), elettroforesi su gel con coppa di carico
- IPG-strip reidratazione e concentrandosi isoelettrico (IEF)
- Reidratare gel DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) in 125 microlitri soluzione di reidratazione [7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] usa il cassetto Immobiline DryStrip Reswelling per almeno 10 ore.
- Sciogliere campione precipitato proteine in un tampone campione IEF [7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] corrispondente a 60-100 mg di proteine per 100 l .
- Dopo solubilizzazione (almeno 30 minuti a temperatura ambiente), si applicano campione di proteine tramite anodica coppa carico con coppe campioni. Il volume della tazza è 100 l (tazze Collettore permette fino a 150 microlitri).
Nota: è possibile caricare quantità di campione più grande se si inserisce una bassa tensione passo all'inizio del protocollo di messa a fuoco e riempire le tazze mentre c'è ancora un film liquido nella tazza! - Eseguire isoelettrofocusing per 11,1 KVH in modalità gradiente nell'Unità Multiphor elettroforesi II.
- Equilibrazione e SDS-PAGE
- Dopo IEF, le strisce IPG sono stati sottoposti a riduzione e alchilazione, ogni volta 15 minuti su uno shaker, con l'1% e al 2,5% ditiotreitolo Iodoacetamide rispettivamente in soluzione di equilibrio [50 mM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M urea, 30% glicerolo e il 2% SDS].
- Lavare le strisce equilibrata con H 2 O e asciugare su carta Whatman loro di rimuovere il tampone in eccesso equilibrio. Successivamente immergere le strisce in SDS-running buffer (1X).
- Seconda dimensione è effettuata mediante SDS-PAGE su sistemi di elettroforesi verticale con una concentrazione di acrilamide totale di 12%. Le strisce IPG equilibrati sono stati collocati sulla parte superiore del gel di separazione e fissato con una soluzione calda agarosio [0,5% di agarosio nella gestione di tampone contenente bromofenolo blu].
- Le proteine sono state separate per 2,5 ore, a partire da 80 V per 15 minuti seguito da 120 V fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo della cassetta gel.
Parte 2: colorazione Coomassie Colloidale con CBB G-250
1. Soluzioni coloranti
Nota: per la preparazione delle soluzioni colorazione, usare prodotti chimici di alta qualità come puri per analisi (pa) e di acqua di elevata purezza, come si ottiene da sistemi Millipore (Milli-Q acqua).
| Coomassie soluzione: | AD 2000 ml H 2 O | |
| 0,02% (w / v) | CBB G-250 | 0,4 g |
| 5% (w / v) | solfato di alluminio (14-18)-idrato | 100 g |
| 10% (v / v) | etanolo (96%) | 200 ml |
| 2% (v / v) | Acido ortofosforico (85%) | 47 ml |
Nota: per la preparazione della soluzione colorante, l'aggiunta sequenziale dei componenti nel seguente ordine deve essere mantenuta:
- prima sciogliere solfato di alluminio in acqua Milli-Q
- successivamente aggiungere etanolo, omogeneizzare e miscelare CBB G-250 alla soluzione
- di recente, la soluzione è completamente sciolto, aggiungere l'acido fosforico (l'incorporazione dell'acido ai media alcolica lascia le molecole si aggregano in Coomassie loro stato colloidale)
- infine si riempiono di acqua Milli-Q
Nota: la soluzione finale ha una colorazione verde scuro-bluastro aspetto ed è piena di particelle di nuoto in giro:
- Non filtrato questa soluzione!
- Se hai cambiato l'ordine di preparazione, si otterrebbe una soluzione più violetto-bluastro che è meno sensibile.
| Decolorazione soluzione: | AD 2000 ml H 2 O | |
| 10% (v / v) | etanolo (96%) | 200 ml |
| 2% (v / v) | Acido ortofosforico (85%) | 47 ml |
2. Procedura di colorazione
- Dopo la separazione seconda dimensione, rimuovere con attenzione i gel dalle lastre di vetro e trasferirli in un piatto colorazione piena di acqua Milli-Q.
- Lavare il gel tre volte con acqua Milli-Q per 10 minuti su un agitatore orizzontale (lavaggio insufficiente provoca scarsa sensibilità perché il restante SDS sul gel disturba la delimitazione del colorante alle proteine).
- Agitare la soluzione di Coomassie prima dell'uso per disperdere le particelle colloidali in modo uniforme.
- Incubare il gel ben coperto con la soluzione di Coomassie di agitazione su un agitatore per 2-12 ore. Questo genera colorazione di fondo marginali in modo da poter osservare i progressi colorazione in mezzo.
Nota: dopo 10 minuti si possono vedere macchie di proteine prima apparizione, entro 2 ore di incubazione di circa l'80% colorazione ad essolivello massimo s è stato completato. Per quasi 100 colorazione%, notte di incubazione è raccomandato. In alcuni casi, quando la quantità di proteine ad essere macchiato è enorme e la soluzione si trasforma in un azzurro brillante, un aggiornamento della soluzione di colorazione è necessario. - Dopo la procedura di colorazione Coomassie rimuovere la soluzione e sciacquare il gel due volte con acqua Milli-Q.
Nota: è possibile riutilizzare la soluzione colorante fino a quando le particelle sono ancora presenti, altrimenti scartare (tenere a mente che il vostro laboratorio può avere norme speciali per lo smaltimento dei rifiuti). - Rimuovere attaccare le particelle del colorante dal piatto colorazione con un panno privo di tovagliolo di carta e Decolorare per 10 - 60 minuti.
Nota: è anche possibile lavare il gel solo con acqua Milli-Q, ma questo si consiglia solo per preparativa gel perché durerà un irregolare, debole film di Coomassie il gel che si presentano durante la procedura di scansione. - Infine risciacquare il gel due volte con acqua Milli-Q: il gel raggiungeranno il loro spessore originale (l'alcool-acido multimediali rende la contrazione gel) e neutralizzazione in acqua aumenta ulteriormente l'intensità del colore di Coomassie.
Parte 3: I risultati rappresentativi
Se si segue il protocollo sopra descritto si ottengono sul 2-D gel distintivi risolto e ben colorati macchie scure proteina blu. Anche rispetto ad un 2-D gel colorato con l'argento secondo Shevchenko et al. 5, un protocollo sostenendo buona sensibilità e la compatibilità con la spettrometria di massa, otteniamo risultati della colorazione uguale.
Figura 1: risultato finale della sperimentazione di cui sopra. Kang Coomassie protocollo (A) esegue con forza come la colorazione argento secondo Shevchenko et al. (B) a individuare le proteine dopo 2-D elettroforesi su gel.
Parte 4: Suggerimenti
- Eseguire alcune colorazioni di prova prima di elaborare i propri campioni. Per motivi inspiegabili abbiamo riportato qualche volta che una proteina di interesse non è stato possibile rilevare con successo anche quando milligrammi sono state applicate. In questo caso si consiglia di preparare alcune serie di diluizioni per testare la sensibilità.
- Se avete a basso contenuto di gel di rilevazione della proteina (s) in generale, il trasferimento senza successo dal accatastamento al gel di separazione durante la SDS-PAGE sarà eventualmente il motivo. È possibile verificare tali proteine adesive dalla colorazione il gel compresa l'area di sovrapposizione.
- Per una rapida verifica dei risultati isoelettrofocusing, è possibile direttamente macchiare la IPG-strip senza alcun ulteriore separazione seconda dimensione.
- Di tanto in tanto girare il gel durante la procedura di colorazione in modo che siano macchiati uniformemente da entrambi i lati (se si mantiene il gel immobile, il colorante si lega solo per una parte del gel).
- Abbiamo sperimentato che lo stoccaggio della soluzione colorante in una bottiglia scura aumenta la sua durata (in bottiglia trasparente fino a 4 mesi).
- Dopo la colorazione e la documentazione è possibile mantenere il gel in frigorifero per diversi anni (se si aggiunge soluzione acida di evitare contaminazioni da funghi).
- Decolorazione di spine gel per un trittico digerire può essere accelerata dal riscaldamento in un riscaldatore blocco.
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Discussion
Innovativi o solo un altro protocollo Coomassie?
Al momento esistono diversi protocolli per le procedure di colorazione con Coomassie Brilliant Blue. La maggior parte di loro il risultato di modifiche minori o maggiori di uno dei protocolli più comunemente utilizzati dai Neuhoff e colleghi 2. Anche il protocollo di Kang basato sulla formula di Neuhoff. Ma è davvero un'alternativa metodo di colorazione Coomassie per la ricerca proteomica? Noi immagine due questioni principali, limite di rilevazione e la fruibilità, a prova che è sicuramente un protocollo di colorazione benefici rispetto ad altri protocolli di Coomassie e colorazioni anche argento e fluorescenti.
Focus I: limite di rilevabilità
Nella pubblicazione di Kang, hanno individuato diverse proteine marker fino a 1 ng / banda (figura 2). Ma a nostro avviso un limite di rilevazione di 4-8 ng / band è più probabile relativi alla pratica (tabella 1). Essi hanno inoltre discusso livelli di sensibilità superiore in relazione sia a un protocollo con Coomassie colloidale CBB G-250 in acido fosforico, solfato di ammonio e metanolo, e una colorazione argento acida (Silver Stain Plus. Kit) dalle biotecnologie Amersham Pharmacia.
Figura 2: Rappresentante SDS-gel pubblicato da Kang et al. che dimostra la potenza di quello modificato CBB-G250 protocollo. 250 ng / banda di proteine sono stati caricati al più a sinistra e 2 volte diluito al lato destro consecutivamente.
Tabella 1: limiti di colorazione per le proteine di serie tratte da pubblicazione Kang rispetto a una soglia più realistico per il rilevamento delle proteine.
| Proteina | MW [kDa] | Proteine quantità [ng] (virtuale vs grave) |
| miosina | 220 | 1 / 4 |
| b-galattosidasi | 116 | 1 / 4 |
| fosforilasi b | 97 | 1 / 4 |
| albumina di siero bovino | 66 | 2 / 4 |
| ovalbumina | 45 | 4 / 8 |
Per confermare questi limiti di rivelazione e di convalidare ulteriormente metodo di colorazione Kang abbiamo effettuato la nostra propria serie di test sul comune Laemmli SDS-gel con marcatori di peso molecolare rilevato da soluzioni per la colorazione fluorescente come Sypro Ruby (BioRad) e Deep Purple (GE Healthcare) (figura 3). È interessante notare che Kang punteggi colorazione bene o addirittura prestazioni migliori (in caso di Deep Purple) ed è quindi decisamente superiore in termini di input di lavoro e prestazioni!
Figura 3: Confronto tra Kang CBB-G250-based colorazione (A) con Sypro Ruby (B) e Deep Purple (GE Healthcare) (figura 3). (C) colorazione di bande di proteine in SDS-PAGE. Un marcatore di peso molecolare contenenti fosforilasi b (97,4 kDa), BSA (66,2 kDa), ovoalbumina (45 kDa), anidrasi carbonica (31 kDa), inibitore della tripsina di soia (21,5 kDa) e lisozima (14,4 kDa) è stato analizzato, con quantità di proteine di 1 g / band sul lato sinistro del gel e consecutivamente diluita di 2 volte a destra.
Tuttavia, questi limiti di rilevabilità sono stati determinati con le proteine standard utilizzato per i marcatori di peso molecolare e dovrebbe essere considerato con cautela. Per questo motivo, abbiamo inoltre testato metodo di colorazione Kang con proteine diverse che hanno in parte debole affinità di legame per CBB (ad esempio Fetuina, mycin). Come dimostrato in figura 4, il protocollo di Kang è superiore alla colorazione CBB convenzionale ed esegue anche meglio di Sypro Ruby, ma non venire a colorazione argento in questo caso. Tuttavia, riteniamo metodo di colorazione modificata Kang è un'alternativa eccezionale per la rilevazione delle proteine sensibili e veloci in gel a base di proteomica.
Figura 4: colorazione delle proteine di Fetuina con (A) protocollo colloidale Kang Coomassie (senza decolorazione) rispetto a (B) un tradizionale CBB G-250 colorazione (40 metanolo% e 10% di acido acetico), (C) Sypro Ryby e (D ) colorazione argento secondo Shevchenko et al. Quantità di proteine di 2 g diluito fino a 2 ng sono stati caricati per SDS-PAGE.
Focus II: l'usabilità
Oltre i limiti di un migliorato rilevamento si Kang Coomassie protocollo offre numerose caratteristiche che lo rende preferenziale verso le colorazioni di Neuhoff o Candiano e protocolli di fluorescenza anche:
- fissaggio e colorazione avviene in un passo
- non più di 4 punti in tutte le
- risultati della colorazione primi sono veloci visibili (nella maggior parte dei casi entro meno di 20 minuti)
- la procedura richiede solo 2 ore per l'80% di completamento della colorazione
- solocolorazione di fondo minimo
- la procedura di colorazione è molto riproducibili (si tratta di un metodo endpoint)
- non una gestione più tossici con l'alcol (metanolo è sostituito da etanolo)
- la soluzione è quasi inodore (senza uso di acido acetico)
- uso di CBB G-250 in basse concentrazioni.
In sintesi, la formula è molto conveniente, relativamente non pericolosi, ambiente amichevole ed a buon mercato. Inoltre colorazione Kang è completamente compatibile con analisi di spettrometria di massa. Alla fine si può dire che la colorazione Coomassie Kang è eccellente per una veloce e di analisi in-gel rilevazione di proteine, anche per gli approcci basati proteomica.
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Disclosures
Non ho nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Nicola Wiethölter per la preparazione e colorazione di 1-D gel.
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e sostenuto da una borsa di ricerca dal Manchot Jürgen Stiftung di ND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| staining dishes with lids | VWR international | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck & Co., Inc. | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
