Summary
成人的心肌细胞原代细胞，可以从动物心脏中分离和培养几天。在这个文化时期的腺病毒介导的基因转移，可以用来表达基因编码的生物传感器（GEBs）或荧光融合蛋白。这两种方法都可以通过共聚焦显微镜细胞调查。
Abstract
从成人心分离的心肌细胞模型某处一侧的胚胎和新生儿的肌肉细胞和其他工作的心脏之间的半路上被广泛接受。因此，心肌细胞，心脏细胞的生理和病理生理的良好模型服务，用于制药的调查，以及转基因动物模型的探索。在这里，我们描述了一种发自内心的细胞分离方法。此外，我们还展示了如何对心肌细胞的基因操纵的培育转基因动物可以不执行：这是长期文化的结合（1周）和腺病毒介导的基因转移。后者是描述，从病毒的建设转导的细胞。它可用于基因编码的生物传感器（GEBs），荧光融合蛋白的表达，同时也为蛋白质的过度表达和向下调节，如利用RNAi。在这里，我们提供一个融合的一个亚细胞结构（高尔基）染色的蛋白质表达例子。这种蛋白的表达，可以通过Z -堆叠的共焦成像的亚细胞结构的三维重建可视化。该协议包括在国家的最先进的细胞培养，分子生物学和生物物理学，从而提供了一个探索新的视野，在蜂窝心脏病的方法。
Protocol
对所有的协议，包含四个主要步骤的设计如图1所示。所有步骤都在全面详细描述。细胞分离，转导和文化，由大约24个小时的共焦成像后是一个连续的和强制性的时间表。该病毒的建设应该做超前的细胞的分离和基因转导，然后使用。
1。成年大鼠心脏心肌细胞的分离
- 成年雄性Wistar大鼠重量约250克（6-12周龄）腹腔注射170μL麻醉每100克体重的解决方案anesthetised
- 此外，柠檬酸钠溶液（2μL/ g体重）注射，以避免手术过程中血液凝固。
- Langendorff灌流的设置应准备。所有的解决方案应与氧饱和。
- 当老鼠是anesthetised，动物固定在手术板上和身体的上半部分是用70％乙醇消毒。
- 通过切割颈动脉的动物被杀害。
- 胸部是用剪刀打开。心脏和主动脉现在应该访问。 pericard被删除。
- 冰冷溶液A +（5毫升）脑室注射均使用26号针头逮捕的心脏和洗出的血液。
- 主动脉抓着钳截断主动脉弓的第一个分支发生。
- 从胸部心脏和主动脉连接到由钳灌注设置和钳位套管，允许逆行的Langendorff灌注。请注意，不要foraminate的主动脉瓣。
- 心脏需要围绕主动脉/导管结扎固定。开放的船只也需要予以结扎。
- 逆行灌注心脏是与氧饱和溶液在室温下约70毫巴的压力在10分钟（23℃）+。确保无气泡进入主动脉。
- 灌注液温度在37到一个Liberase解决方案交换℃，约25分钟蠕动泵率在4毫升/分钟。在灌注结束的心应该寻找大理石白色。消化时间可能需要适应形势/组织条件。
- 取自心脏灌注设置，并在培养皿中的解决方案包含一个放置在温度37 ° C剩余的船只和心房被切断。这些船只将被丢弃和心房 - 如果需要的话 - 区别对待（不是这个协议的一部分）。心室分为约6件。
- 件转移到100毫升锥形含有20毫升溶液在温度37℃，并在37℃水浴5分钟稍微激动。烧瓶最后被丢弃上清液。
- 上述过程重复一次或两次。上清应该出现轻微不透明。
- 开始添加20毫升溶液B 1 / 2，在37 ° C到细胞和组织，其余的解决方案，剩余的胞外钙离子浓度的增加是一个锥形瓶中。这是有点动摇了，37℃水浴一个额外的5分钟。随后被丢弃上清液。
- 进一步增加20毫升溶液B：1 / 2 。 （解决方案/上清现在应该包含活菌）。细胞下降是一个倒置细胞培养显微镜转移到培养皿。如果细胞显示出较高的自发活动（收缩）之一需要等到细胞来休息。
- 再一次被丢弃上清液，并添加20毫升溶液B 1 / 2 。
- 以这样的方式，组织块时，容易激动，通过开放，可以通过塑料巴斯德吸管尖被切断。具有阻燃处理，锐利的边缘软化（融化）。
- 现在的组织块稍微轻轻磨碎。组织块“土崩瓦解”，进入细胞内。
- 细胞含有上清倒出，并与B液稀释，以达到所需的细胞密度，这取决于类型的实验，并应凭经验确定。
2。建筑的融合蛋白转导腺病毒
生产腺病毒的移调，广告MP生物医学的腺病毒载体系统是用 1 。该协议开始与现有的和测试向量入口为荧光融合蛋白或创业板第2条 （pCR259）。
- 上述初步pCR259包含感兴趣的基因的载体的10纳克量100μLHighQ移调- AD - 1™294胜任细胞转化。
- 这种混合物孵育20分钟冰热休克45秒在42 ° C，其次是存储在一个额外的2分钟冰。
- 新增900＆万亩;升非选择性LB 培养基和成长在37 ° C的4小时轻轻摇动。
- 板50μL，100μL和200μL含有氯霉素（CM，20微克/毫升），氨苄青霉素（100微克/毫升），四环素（15微克/毫升），X - Gal的（280微克/毫升LB培养基板）和IPTG（40微克/毫升）。 （可能是一个更加激烈和更快的蓝染色300μg/ml使用较昂贵的染料Bluo - Gal的，这应该是尤其当你没有识别和区分蓝色/白色菌落如此熟悉）
- 24小时，增长在37 ° C。在4℃直至离开良好的识别蓝色菌落可能。当有问题，以决定它的殖民地，是真正的白色挑选的一些殖民地，并复制在另一盘含有三种抗生素，X - gal和IPTG，让他们成长在夜间在37 ° C.
备注）HighQ - 1移调AD™294细胞中含有两个重要的质粒，腺病毒骨架（移调- AD™294）和辅助质粒表达了一个感兴趣的基因插入到它的目标网站，从而介导的转座，位于在移调公元294 LacZ基因质粒。 - 要确定阳性克隆含有基因的病毒骨干的利益进行菌落PCR在2.7-2.9所述。使用载体引物侧翼多个克隆网站（向前5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3'，反向5'GCGGATAACAATTTCACACAGG 3'），并与100％的白色菌落菌落PCR和使用无插入的基因作为控制移调-公元294质粒一个蓝色的殖民地利益。蓝色菌落会给你一个简短的PCR片段（〜200bp），包含您感兴趣的基因的殖民地，一个大的PCR产物（取决于你感兴趣的基因的长度），与两个片段多个细胞克隆菌落，必须分开如果进一步使用。
- 根据下面的主结构表，需要有所准备。
- 蒸压牙签挑选一个100％的白色菌落，首先要对这个殖民地复制与厘米的LB板。
- 转移到PCR混合殖民地。在PCR混合捻取出牙签之前，可以浸泡很多的PCR混合的3-4倍。 PCR协议取决于插入和使用聚合酶KB。引物的退火温度是57 ° C和35个循环使用建议。
- 增长的阳性克隆的夜间文化（LB培养基与CM）和隔离与商业没有离心柱的试剂盒质粒，因为，在离心力的作用，破坏了庞大的病毒载体。
- 变换0.5微克100μL的DH5α感受态细胞中分离出质粒。孵育30分钟冰细胞的DNA。热休克45秒42 ° C和冰浴2分钟的设置。
- 加入900μL无选择性LB培养基，生长在37℃，轻轻摇动1小时。
- 板50μL含厘米，X - gal和IPTG的LB培养基上板。在37 ° C培养24小时。
- 选择和复制20 100％单独氨苄青霉素，四环素和氯霉素板含有IPTG和X - Gal的白色菌落。让他们在一夜之间成长在37 ° C。选择是100％的白色，耐氯霉素，氨苄青霉素和四环素敏感的殖民地。
- 菌落PCR（可选）：阳性克隆可与殖民地PCR测试，检查它们是否包含插入。
- 挑选单菌落了积极的重组，并与CM 600毫升LB培养基中生长。
- 使用质粒马克西试剂盒分离的质粒。
- 精华5微克质粒用Pac我的两个小时，在37 ° C和反应停止在65 ° C为20分钟。
- 在SpeedVac整个消化集中在室温为30分钟到终体积为10μl，或使用酚 - 氯仿的提取方法。
- 解冻一小瓶冷冻QBI - HEK 293细胞在37℃水浴中轻轻摇动。小瓶用70％乙醇冲洗外，并在无菌罩在无菌条件下进行。
- 传递细胞15毫升无菌试管中，滴加10毫升的DMEM（10％FCS）的添加而温柔的搅拌，并在250xg离心10 min沉淀细胞。
- 弃上清。于10 ml DMEM（10％FCS）的向上和向下轻轻吹打重悬沉淀。
- 种子在75厘米2烧瓶，添加10毫升含10％FCS的DMEM细胞。 37 °，在夜间在5％的CO 2培养箱彗星。
- 第二天验证的细胞密度。 QBI - HEK 293细胞，应分别在1:10至1:20的比例。
- 从细胞中取出的中型和trypsinize 2毫升为1-3分钟胰蛋白酶。给予10毫升的DMEM细胞，并在250xg离心10分钟。
- 小心取出介质和细胞10毫升的新鲜培养基，重新悬浮细胞计数。
- 板六以及与5 2X10，3X10 5 5，5X10 5和6x10 5个细胞。菜在37 ° C中的CO 2培养箱。
- 使用50％汇合在翌日良好的转染与集中的PAC我消化。我们有很好的经验与脂质体2000转，但还有其他方法（如磷酸钙转）应该是合适的。
- 在转染前3-4小时更改中期进入指数增长，在手术过程中的细胞。
- 5μL脂质体在室温下混合5分钟与250μLDMEM培养。
- 给予脂质体中等混合的DNA“（PAC我消化），并通过对反应管，混合，不吹打混合。在室温下孵育混合物20分钟。
- 掉落细胞的转染混合物和岩石混合板。在37 ° C孵育5％的CO 2。更改后4-5个小时的中等。
- 转染后两天从细胞中，并给到一个新的培养瓶（75厘米）。
- Trypsinize用500μl胰酶长达5分钟的细胞。给予1毫升的DMEM细胞，整个混合物，并把它连同17毫升新鲜培养基的培养瓶中（与FCS的DMEM）。培养的细胞在37℃，5％的CO 2，直到细胞病变效应（CPE），是可见的。见图2，学习如何CPE应该像。
- 与介质的细胞收集在50毫升管和冻结的细胞在-80 ° C。打破三个冻结/解冻循环（-80 ° C/37 ° C水浴）的细胞。
- 离心20分钟，在8000xg和4 ° C。到一个100mm直径碟倒出上清液，弃去沉淀。使用孔径0.45μm的无菌过滤，滤液上清。这是第一个病毒的股票（通道1）。
- 使用这种股票的1 / 3转导一个75厘米 2烧瓶QBI - HEK 293细胞70％汇合。在37 ° C和5％的CO 2，直到CPE的小号是可见的。
- 如果细胞CPE的小号收集和提取的病毒之前完成。这是通过病毒2。
- 2.37和2.38病毒通过重复步骤2和病毒的扩增，依此类推，直至达到足够的病毒库存。该病毒可集中与特定的离心管（Amicon超15离心ultracel - 100微孔膜过滤装置），数个月，储存在-80 ° C要计数的传染性颗粒，使用斑块检测。
- 通过2或更高的病毒转导的细胞和病毒的进一步放大。
3。原代细胞培养和腺病毒转导
- 无菌直径20毫米的圆形盖玻片，放置在标准12孔板。
- 20μL的ECM解决方案是均匀分布在每个盖玻片。遗体被丢弃。让干燥至少1小时在37 °或者涂层可以通过干燥，夜间在室温（12小时）。
- 每口井是充满了1毫升中等M199包括抗生素和ITS的补充。
- （从1.21步）一个200至400μL细胞悬液，每孔加入。培养的细胞发生在37 °彗星在5％ 二氧化碳培养箱。
- 细胞允许泥沙和1 h后的介质改变。
- 一个足够量的病毒解决方案（通过2或更高）混合后立即改变中期轻摇板。
- 在一个长期培养基的情况下，每2天。
- 24小时后转创业板的表达被觉察。
4。共焦成像3D的亚细胞结构和Ca 2 +信号
可以执行任何共聚焦显微镜共焦成像。然而，钙离子成像实验需要至少视频率（25-30赫兹）的采集速度。这就限制了可用的技术或者多束扫描仪（如尼普科夫光盘，席卷领域或公斤光束阵列扫描仪）或非常快的单光束扫描仪（如共振扫描仪或声光偏转器（AOD），扫描仪）。有关概述，见参考文献。 3。亚细胞的三维成像，需要一个Z驱动器。在这里，一公斤光束阵列扫描仪（VTinfinity，VisiTech诠释，桑德兰，英国）使用。
- 显微镜及周边设备需要设置到运作模式。特别是激光，这可能需要变暖期，直到达到一个稳定的输出功率。
- 细胞需要被转移到一个试验室（盖滑转移）。与细胞的盖玻片被转移到一个试验室。然后加入1ML Tyrode液（含1.8毫米的细胞外钙）。
- 试验室需要放置在显微镜舞台上。刺激电极，灌注设置和进一步peripheRAL设备，如温度控制，需要作出相应安排。
- 细胞将集中在使用白光和/或啶照明选择。
- 采集参数，如激光功率，曝光时间等，或一个完整的实验协议需要设置。
- 时间序列和/或Z节的图像可以被收购。
- 在进一步设置先进的多模测量，可以使用电（膜片钳）和/或光学操纵像再分配后，荧光光漂白（FRAP）包括两个光子光解物质uncaging。
- 图像分析，特别是如Imaris（位平面AG，瑞士苏黎世），速度（即兴创作，英国考文垂）或Arivis浏览器（arivis有限责任公司，德国罗斯托克）的专用分析软件进行三维重建。
5。代表性的成果：
该协议的最终结果是图像，可用于提取进一步的数据序列。
一个例子是，亚细胞结构和细胞器的调查。图3描绘了高尔基体的3维排列的例子。所有的调查，在电子显微镜，可以进行活体细胞。
图1：一般流通的主要实验步骤。
图2：左图描绘文化的Q - HEK 90-95％汇合的细胞是不转。 Cytopatic病毒转导后的效果显示在右边的部分。细胞轮和分离板的底部。在这些细胞中的细胞核占据细胞的重要组成部分，作为一个活跃的病毒生产。
图3：成人与YFP的融合蛋白，针对高尔基体转染大鼠心肌细胞。腺病毒介导的基因转移（文化一天）后的心肌细胞表达的荧光融合蛋白。 A组描绘了一个单一的焦片从Z - Stack的。在B组中，描述了相同的细胞后，用一个理论点扩散函数（PSF）反卷积。随后用此去模糊图像的堆栈来呈现细胞和面板C或三维表面重建（四）所示，得到一个三维容积重建。酒吧代表10微米。
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Discussion
鼠心肌细胞的分离描述的过程可以适应其他物种，例如鼠标 4，如有必要。需要适应的一个参数，对消化酶的组合（见下文）和消化的时间。要知道，有些种类（如鼠标）的细胞可能会比其他人（如鼠）更脆弱。
胶原酶的选择可能是在隔离过程中最关键的一步。我们选择Liberase Blendzyme，因为它是一种合成酶的组合几乎没有批到批的变化。传统的方法是使用所谓的原油从梭菌histolyticum，这也是一个有效的方法提取胶原酶。然而，一批批的变化，需要为每个新的一批新的优化。
除了 荧光融合蛋白和创业板转的腺病毒介导的基因转移，也可以用于功能蛋白的过度表达或下调（ 例如 ，通过RNAi 5）。这也是如此，因为转染效率高（> 95％）和可重复性。
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Acknowledgments
这项工作是由德国国家科学基金会（DFG）和联邦风险评估研究所（BFR，德国）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | |
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | ||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | ||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | ||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution:10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | ||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | ||
| DNase solution | Sigma-Aldrich | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithi–rythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mLmedium M199 |
| Culture medium M199 | PAA Laboratories | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clearsolution. Aliquots can be frozen. | ||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | ||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | ||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | ||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA,0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, Molecular Imaging II. Licha, K., Lin, C. P. Vol. 7370, SPIE. Bellingham. 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Shorte, S. L., Frischknecht, F. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , Springer. Berlin Heidelberg. 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P. Optics in Life Science. Popp, J., von Bally, G. Vol. 6633, SPIE. Munich. 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
