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Biology

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

doi: 10.3791/1433 Published: September 17, 2009

Summary

成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー(GEBs)または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。

Abstract

成人の心臓から単離された心筋細胞は広くどこかにモデル片側の胚および新生児の筋細胞と他の上で働く心臓の間に半分の方法として受け入れられています。従って、心筋細胞は心臓細胞生理および病態生理のため、医薬品の調査のためだけでなく、トランスジェニック動物モデルを検証するための良いモデルとなる。ここでは、心臓から細胞を単離する方法を説明します。さらに我々は心筋細胞で遺伝子操作がトランスジェニック動物を飼育することなく実行できる方法を示します:これは長期の培養(1週間)とアデノウイルス遺伝子導入を組み合わせたものです。後者は、ウイルスの構造から細胞の形質導入に記述されています。それは、RNAiを用いて、例えば、発現とダウンレギュレーションを介して遺伝的に符号化されたバイオセンサー(GEBs)、蛍光融合タンパク質を発現させるためだけでなく、蛋白質に使用することができます。ここでは、細胞内構造(ゴルジ体)を染色する融合タンパク質を発現させるための例を提供しています。このようなタンパク質の発現は、細胞内構造の3次元再構築のためのz -スタックの共焦点イメージングで可視化することができる。プロトコルは、細胞培養、分子生物学と生物物理学の最先端を構成し、従って細胞の心臓病の新たな地平を探索するためのアプローチを提供します。

Protocol

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4つの主要な段階を含むプロトコルのすべての設計上の図1に示します。すべてのステップは、完全な詳細に説明されています。 24時間後に約共焦点イメージングに続いて細胞の分離、伝達と文化は、連続すると強制的なタイムスケールです。ウイルスの構造は、先に細胞の分離の行われる必要がありますし、遺伝的形質導入のために使用されます。

1。ラットの心臓から成人心筋細胞の単離

  1. 成体雄のWistarラット重量で約250 gは(6-12週齢)100gの体重あたり170μlの麻酔液の腹腔内注射によってanesthetisedです
  2. さらに、クエン酸溶液(2μL/ g体重)が手術中に血液凝固を防ぐために注入されます。
  3. ランゲンドルフ灌流セットアップを準備する必要があります。すべてのソリューションは、酸素で飽和されるべきである。
  4. ラットがanesthetisedの場合は、動物は、手術の基板上に固定されており、ボディの上部を70%エタノールで消毒されています。
  5. 動物は、頸動脈を切開によって殺される。
  6. 胸部は、はさみを使って開かれます。心臓と大動脈が現在アクセスできるはずです。 pericardは削除されます。
  7. 氷冷溶液A +(5 ml)を心を逮捕し、血液を洗い流すために26ゲージ針を用いて両心室に注入される。
  8. 大動脈をクランプでつかんで、大動脈弓で切り捨ては最初の分岐が発生したさ。
  9. 心臓が胸から削除され、大動脈を灌流鉗子と逆行ランゲンドルフ灌流を可能にするためにクランプによるセットアップのカニューレに接続されています。大動脈弁を有孔のしないように注意してください。
  10. 心臓は、大動脈/カニューレ約結紮によって修正する必要があります。オープン船もライゲーションする必要があります。
  11. 心臓は逆行約70ミリバールの圧力で10分間、室温で+(23 ° C)、酸素飽和溶液で灌流される。に気泡が大動脈を入力していないことを確認してください。
  12. 灌流液を37℃の温度でリベラーゼソリューションに切り替えられる℃の蠕動ポンプによる4ml /分の速度で約25分間。灌流の最後に心臓は大理石白になるはずです。消化時間は、状況/組織の条件に適合させる必要があるかもしれません。
  13. 心臓は、灌流セットアップから採取し、37℃の温度でペトリ皿を含む溶液中に配置されます残りの血管と心房が遮断されています。血管が破棄され、心房 - 必要に応じては - (ではない、このプロトコルの一部)異なる方法で処理されます。心室は約6枚に分かれています。
  14. 作品は、温度37℃、わずか5分間37℃のウォーターバス中で攪拌し20 mlのソリューションを含む100 mL三角フラスコに移しています。最後に上清は廃棄されます。
  15. 上記の手順は一度か二度繰り返されます。上清は、わずかに不透明に表示されます。
  16. 細胞外カルシウム濃度の増加は、37℃で溶液B 1 / 2の20mlを加える° C三角フラスコ内の溶液の残差を、残りの細胞や組織にすることで開始されます。これは、少し追加の5分間37℃の水浴中で振とうする。その後、上清は廃棄されます。
  17. 20 mlのソリューションをさらにB 1 / 2を追加。 (ソリューション/上清は、現在、生細胞が含まれている必要があります。)セルのドロップが反転細胞培養顕微鏡でペトリ皿に移される。細胞は、高い自発活動(収縮)細胞が休息に来るまで待つ一つのニーズを示す場合。
  18. 再び上清を捨て、溶液B 1 / 2の20mlを加えています。
  19. プラスチック製パスツールピペットの先端は、開口部を介して攪拌するときに組織片を容易に通過できるように切り取られている。火炎処理でシャープなエッジが(溶融)軟化している。
  20. 今組織片はわずかに、穏やかに摩砕しています。組織片は、細胞内に"バラバラになる"はず。
  21. 上清を含有する細胞をデカントし、実験の種類に依存し、経験的に決定されるべき所望の細胞密度に到達する溶液Bで希釈する。

2。融合タンパク質の形質導入のためのアデノウイルスの構築

アデノウイルスを生成するためのMPバイオメディカルからトランスポーズ-広告アデノウイルスベクターシステムは、1を使用されています。このプロトコルは、蛍光融合タンパク質またはGEB S 2のために利用できるとテストされたエントリーのベクトル(pCR259)から始まります。

  1. 目的の遺伝子を含む上記の初期pCR259ベクトル10ngの量は100μlのHighQ - 1トランス- AD™294コンピテントセルで形質転換される。
  2. この混合物を42℃で45秒熱ショック° Cに続いて、さらに2分間氷上で保存されて氷上で20分間インキュベートする。
  3. 900&ムーを追加、4時間穏やかに振とうさせながら非選択LB -培地、37で成長℃でlの。
  4. プレートを50μl、クロラムフェニコール(Cm、20μg/ ml)を、アンピシリン(100μg/ ml)を、テトラサイクリン(15μg/ ml)を、X - Galを(280μg/ mlのLB培地を含むプレートに100μlと200μlの)とIPTG(40μg/ mlの)。 (より強いと速くブルー染色では300μg/ml、より高価な染料Bluo - Galを使用することで可能になります。これは、特に使用する必要が白/青コロニーを認識し、区別するのにそう慣れていない時)
  5. 37℃で24時間成長℃に青色のコロニーの良い識別が可能になるまで4℃のまま。コロニーのいくつかを選んで三抗生物質を含む別のプレート上に複製本当に白である植民地を決定する問題は、X - GalとIPTG、それらを37℃で一晩成長させ℃までがあるとき
    備考)HighQ - 1トランス- AD™294細胞は二つの重要なプラスミドが含まれます:あるアデノウイルスのバックボーン(トランスポーズ - 広告™294)と、その標的部位に目的遺伝子の挿入を媒介するトランスポゼースを発現するヘルパープラスミドを、プラスミドトランス- AD 294のLacZ遺伝子インチ
  6. ウイルスのバックボーンへの関心の遺伝子はとして2.7から2.9に記載されてコロニーPCRを行う含む陽性コロニーを同定するために。 (、リバース5'GCGGATAACAATTTCACACAGG 3'前方に5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3')、複数のクローニング部位に隣接するベクトルのプライマーを使用し、100%ホワイトコロニーをコロニーPCRを行い、挿入遺伝子なしでトランスポーズ- AD 294プラスミドの制御として1つの青色コロニーを使用してください興味のある。青色のコロニーがあなたに短いPCR断片(〜200bp)を与える、目的遺伝子を含むコロニーは、大規模なPCR産物を(目的の遺伝子の長さに応じて)表示され、二つのフラグメントを持つコロニーは複数の細胞コロニーであり、分離しなければならないさらに使用する場合。
  7. マスターミックス下の表に従って準備する必要があります。
  8. オートクレーブ爪楊枝で単一の100%ホワイトコロニーを採取し、最初のCmを含むLBプレート上でこのコロニーの複製を作る。
  9. PCRミックスにコロニーを移す。 PCRミックスでは、PCRミックスを大量にソークができる前に爪楊枝を削除するよりも3〜4回、それをクルクル回す。 PCRプロトコルは、挿入と使用されるポリメラーゼのキロバイトに依存します。プライマーのアニーリング温度が57℃、35サイクルの使用が推奨されています。
  10. 陽性クローンの夜の文化を(CMを含むLB -培地)上に成長すると遠心力が巨大なウイルスベクターを中断させるため、スピンカラムの無い市販のキットでプラスミドを分離。
  11. 100μlのコンピテント細胞の単離されたプラスミド0.5μgを変換する。氷上で30分間細胞とDNAをインキュベートする。熱ショック42℃45秒℃、2分間氷上で設定された。
  12. LB -培地900μlの非選択的に追加し、37℃で1時間穏やかに振とうさせながらC。
  13. CM、X - galおよびIPTGを含むLB -培地を含むプレート上にプレートを50μl。 24時間、37℃でインキュベートする。
  14. ピックとIPTGとX - Galを含む別個のアンピシリン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールプレート上で20の100%ホワイトコロニーにまで複製されます。それらを37℃で一晩成長しましょう​​℃に100%白、クロラムフェニコール耐性、アンピシリン及びテトラサイクリン敏感なコロニーを選択してください。
  15. コロニーPCR(オプション):陽性クローンは、彼らはインサートを含んでいることを確認するためにコロニーPCRで再びテストすることができます。
  16. 肯定的な組換えの単一コロニーを採取し、Cmを600mlのLB -培地で成長する。
  17. プラスミドマキシキットを使用してプラスミドを分離します。
  18. ダイジェスト37 2時間Pac Iでプラスミド5μgの℃および65℃で反応20分間の停止。
  19. 10μlの最終容量を30分間室温でSpeed​​Vacで全体のダイジェストを集中またはフェノール - クロロホルム抽出法を使用してください。
  20. 37℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら凍結QBI - HEK 293細胞のバイアルを融解する。 70%エタノールでバイアルの外側をすすぎ、滅菌フードで無菌的に進んでください。
  21. 、滅菌15 mlのチューブに細胞を移し、穏やかな攪拌しながら滴下10ミリリットルDMEMを(+10%FCS)を追加し、250xgで細胞をペレットに10分を遠心分離。
  22. 上清を捨てる。優しく上下にピペッティングして10ミリリットルDMEM(+10%FCS)でペレットを再懸濁する。
  23. 75センチメートル2フラスコでシードし、細胞に10%FCSで10ml DMEMを加える。 37℃で一晩インキュベート℃、5%CO 2インキュベーターでC。
  24. 翌日、細胞密度を確認してください。 QBI - HEK 293細胞は1:10〜1:20の割合で分割する必要があります。
  25. 細胞から培養液を除去し、1〜3分の2 mlのトリプシンでトリプシン処理。 10分間250xgで細胞と遠心に10ミリリットルDMEMを与える。
  26. 慎重に培養液を除去し、細胞に10 mlの新鮮な培地を与え、再懸濁し、細胞を数えます。
  27. 2 × 10 5とだけでなく、6ウェルいずれかのプレート、3 × 10 5 5、5 × 10 5と6 × 10 5細胞。 37皿をインキュベート° CをCO 2インキュベーターで。
  28. 次の日に集中Pac Iで消化し ​​てトランスフェクトするために50%コンフルエントで井戸を使用してください。我々は、リポフェクタミン2000トランスフェクションとの良好な経験を持っているだけでなく、他の方法(例えば、リン酸カルシウムトランスフェクションなど)に適しているはずです。
  29. 手順の実行中に急激な成長に細胞を得るためにトランスフェクションの前にも3〜4時間で培地を変更します。
  30. 5分間室温で250μlのDMEMとインキュベートして5μlをリポフェクトアミンを混ぜる。
  31. 反応チューブに対してタップすることで、DNA(Pac Iでダイジェスト)とミックスにリポフェクタミン-ミディアム混合物を得た、ピペッティングにより混合していない。室温で混合20分インキュベートします。
  32. 細胞にトランスフェクション混合物をドロップしてミックスするプレートを揺らし。 37℃5%CO 2をインキュベートする。 4-5時間後に培養液を交換する。
  33. トランスフェクション後の二日後には細胞から培地を取り出し、新鮮な培養フラスコ(75 cm 2)のにそれを与える。
  34. 最大5分までの500μlのトリプシンで細胞をトリプシン処理。セルに1ミリリットルDMEMを与える、混合物全体を取るし、培養フラスコに17ミリリットルの新鮮な培地(FCS含有DMEM)と一緒に、それを置く。 37細胞を育成℃、5%CO 2でCを細胞変性効果(CPE)が表示されるまで。 CPEがどのような方法については、図2を参照してください。
  35. 50 mlチューブに培地で細胞を回収し、-80細胞を凍結℃に3回の凍結/解凍サイクル(-80℃C/37 ° Cのウォーターバス)で細胞を壊す。
  36. 8000xg、4時20分を遠心℃に100㎜径の皿に上清をデカントし、ペレットを捨てる。ろ液に上清を0.45μm孔径を持つ滅菌フィルターを使用してください。これは最初のウイルスの株式(継代1)です。
  37. 70%コンフルエントとQBI - HEK 293細胞を75センチメートル2フラスコを形質導入するために、この株式の1 / 3を使用してください。 37 ° C、5%CO 2 CPEのが見えるようになるまで。
  38. 細胞はCPE sがそれらを収集し、前に行ってウイルスを抽出表示した場合。これはウイルスの継代2です。
  39. ウイルス通路と手順2.37と2.38を繰り返して2などのウイルスの増幅は、十分なウイルス株に達するまで。ウイルスは、特定の遠心チューブ(Millipore社からultracel - 100膜とアミコンウルトラ- 15遠心式フィルターユニット)で濃縮し、-80℃で数カ月間保存できますカウントするには感染性粒子は、プラークアッセイを使用してください。
  40. 細胞を形質導入し、ウイルスのさらなる増幅のためにウイルスの継代2以上を使用してください。

3。初代培養細胞とアデノウイルスの形質導入

  1. 直径20mmの滅菌円形カバースリップは、標準の12ウェルプレートに配置されます。
  2. 20μlのECMソリューションは、均等に各カバースリップで配布されています。遺跡は破棄されます。乾燥のために37℃で1時間の最小値を許可する℃、あるいはコーティングは、室温で(12時間)一晩乾燥することができます。
  3. 各ウェルは、抗生物質とITSを構成するサプリメントを1 mlの培地M199で満たされている。
  4. 200〜400μLの細胞懸濁液は、(ステップ1.21から)の各ウェルに添加する。細胞の培養は、37℃で生じる5%CO 2インキュベーターでC。
  5. 細胞は、堆積物に許可され、1時間後の培地が変更されます。
  6. すぐにメディアを変更した後に、ウイルスを含む溶液(通路2以上から)の十分な量を穏やかにプレートを揺らすことによって混合される。
  7. 長期培養培地の場合は2日毎に変更されます。
  8. トランスフェクションGEBの発現後24時間は検出可能です。

4。 3D細胞内構造とCa 2 +シグナリングのための共焦点イメージング

共焦点イメージングは​​、任意の共焦点顕微鏡で行うことができます。しかし、カルシウムイメージング実験は、少なくともビデオレート(25 Hz)の買収の速度を必要とする。これは、マルチビームスキャナ(例:ニプコーディスク、フィールドまたはキロビームアレイスキャナーを掃引)、または非常に高速なシングルビームスキャナ(例えば共振スキャナまたは音響光学デフレクタ(AOD)、スキャナ)のいずれかに使用可能な技術を制限する。概要については文献を参照してください。 3。 3D -細胞内イメージングは​​、z -ドライブが必要です。ここキロビームアレイスキャナー(VTinfinity、VisiTechのInt。、サンダーランド、イギリス)が使用されます。

  1. 顕微鏡と周辺機器は、動作モードに設定する必要があります。安定した出力電力に達するまで、特にレーザーのためにこれは、期間ウォーミングアップが必要な場合があります。
  2. 細胞は実験室(カバースリップの転送)に転送する必要があります。細胞をカバースリップは、実験室に転送されます。 1mLのタイロード溶液(1.8 mMの細胞外カルシウムを含む)を添加する。
  3. 実験室では、顕微鏡ステージ上に配置する必要があります。刺激電極、およびさらにperiphe血流アップセットRALデバイス、例えば、温度制御は、それに応じて配置する必要があります。
  4. 細胞は、で焦点と白色光及び/または落射蛍光照明を使用して選択されます。
  5. レーザパワー、露光時間等又は実験全体のプロトコルなどの取得のパラメータは、設定する必要があります。
  6. 時系列および/またはZ断面の画像を取得することができます。
  7. セットアップ、さらに高度なマルチモードの測定で電気生理学(パッチクランプ)または/および蛍光光退色後の再分布(FRAP)または2つの光子の光分解を含む物質のアンケージングなどの光マニピュレーションを使用して行うことができます。
  8. 画像の解析、特に3D -再建は、Imaris(ビットプレーンAG、チューリッヒ、スイス)、速度(インプロビゼーション、コベントリー、イギリス)またはArivisブラウザ(arivis社、ロストック、ドイツ)などの専用解析ソフトウェアで実行されます。

5。代表的な結果:

プロトコルの最後の結果は、さらにデータを抽出するために使用できるイメージのシーケンスです。

例では、細胞内構造と細胞小器官の調査です。図3は、ゴルジ装置の三次元配列の例を示しています。電子顕微鏡とは対照的にすべての調査は生きている細胞で行うことができます。

図1
図1:主要な実験手順の一般的な流れ。

図2
図2:左の画像は、形質導入されていない90〜95%コンフルエントで培養中のQ - HEK細胞を描いている。ウイルス形質導入後のCytopatic効果が右部分に表示されます。細胞は切り上げとプレートの底部から切り離す。これらの細胞で核は​​、アクティブなウイルス産生の結果として細胞の大部分を占めている。

図3
図3:ゴルジ体を標的とYFP融合タンパク質をトランスフェクトしたアダルトラット心筋細胞。アデノウイルス遺伝子導入(文化の一日)後の心筋細胞は、蛍光融合タンパク質を発現する。パネルは、z -スタックから取り出した単焦点スライスを示しています。パネルBでは、同じ細胞は理論上の点像分布関数(PSF)を使用してデコンボリューション後に描かれている。このデ-ぼやけた画像のスタックは、その後、セルを描画し、パネルCまたは3D表面再構成(D)に示すように3次元ボリュームの再構築を取得するために使用されます。バーは10μmを表す。

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Discussion

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ラット心筋細胞の単離のために説明する手順は、必要に応じて他の種、例えばマウス4に適合させることができます。適応を必要とするパラメータは、消化のための酵素ミックス(下記参照)、また、消化の期間です。一部の種(例えばマウス)の細胞が他の人(例えばラット)よりも壊れやすいかもしれないことに注意してください。

コラゲナーゼの選択は、おそらく分離手順の中で最も重要なステップです。それは事実上無バッチ間のばらつきを持つ合成酵素ミックスなので、我々は、リベラーゼBlendzymeを選択します。従来の方法も有効な方法であるクロストリジウムヒストリ、から抽出された、いわゆる原油コラゲナーゼの使用です。しかし、バッチ間のばらつきは、それぞれの新しいバッチのための新しい最適化が必要です。

離れて蛍光融合タンパク質とGEBの伝達からアデノウイルス遺伝子導入は、機能性タンパク質またはそれらのダウンレギュレーション(RNAiの5によるなど)の過剰発現のために使用することができます。導入効率が高い(> 95%)と再現性があるので、これは当てはまります。

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Acknowledgments

この作品は、ドイツの国立科学財団(DFG)およびリスク評価のための連邦研究所(BfRは、ドイツ)によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia solution Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid)
Citrate solution 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution
Solution A 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Solution A+ Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Liberase solution F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. 11988476 001 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution:10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.)
Solution B Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution
Solution B1/2 1:1 mixture of solution A and solution B
DNase solution Sigma-Aldrich D4527 Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithi–rythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol
Extracellular matrix protein (ECM) solution Extracellular matrix protein (ECM) solution E1270 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mLmedium M199
Culture medium M199 PAA Laboratories E15‐834 Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml)
ITS solution 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clearsolution. Aliquots can be frozen.
Tyrode 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Master mix 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample
LB‐Medium 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0
Pac I New England Biolabs R0547L preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA,0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl

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References

  1. Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, Molecular Imaging II. Licha, K., Lin, C. P. Vol. 7370, SPIE. Bellingham. 737008-737008 (2009).
  2. Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43, (1), 59-59 (2008).
  3. Shorte, S. L., Frischknecht, F. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. Springer. Berlin Heidelberg. 289-289 (2007).
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  5. Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
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Cite this Article

Kaestner, L., Scholz, A., Hammer, K., Vecerdea, A., Ruppenthal, S., Lipp, P. Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (31), e1433, doi:10.3791/1433 (2009).More

Kaestner, L., Scholz, A., Hammer, K., Vecerdea, A., Ruppenthal, S., Lipp, P. Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (31), e1433, doi:10.3791/1433 (2009).

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