Summary
قمنا بتطوير شبه الآلي التحليل البصري نبضات أسلوب (سهى) لتحليل تسجيلات عالية السرعة الضوئية من
Abstract
طورنا طريقة لتحليل تسجيلات عالية السرعة الضوئية من
Protocol
انقر هنا لعرض لمحة عامة عن الإجراءات نبضات شبه الآلي (سهى) التحليل.
شبه الآلي تحليل نبضات ضوئية
1. Preprocess --
هذه الخطوة توفر معلومات عن القلب الانبساطي وبأقطار الانقباضي.
ويتم تحديد حواف القلب وملحوظا خلال انبساط وانقباض الأقصى. يمكن أن تكون التسجيلات البصرية المتطورة بسرعة بطيئة وإطار واحد ، حتى في الوقت الذي تسمح بتحديد دقيق للإطارات حيث تقلص القصوى والاسترخاء للقلب تحدث. مصنوعة زوج واحد من علامات التعرف على حواف الانبساطي وزوج واحد تحديد حواف الانقباضي. ويمكن أيضا أن تكون علامات المحرز في مكررة في مواقع مختلفة على طول الأفقي القلب.
وتستخدم أيضا في أقطار القلب في هذه الخطوة التي تم الحصول عليها لحساب القياس الإضافية التي تقدم تقديرا للانقباض القلب. هذا الاجراء هو تقصير في المئة كسور (٪ FS) ، وأنها تمثل مدى حواف القلب التحرك نحو بعضهما البعض خلال الانكماش. الصيغة المستخدمة لحساب FS ٪ هو :
(((الانبساطي قطر -- قطر الانقباضي) / قطر الانبساطي) × 100)
علما -- وتستخدم النقاط المحددة في هذه المجموعة فقط لقطر والقياسات وكسور تقصير لا تستخدم للكشف عن الحركة.
على سبيل المثال : (. Cammarato ، وآخرون 2008) في ذبابة الفاكهة ، والطفرات نقطة في المجال محول الميوسين السلسلة الثقيلة ، وهي المنطقة المعروفة لتعديل النشاط الحركي والأنزيمية ، النتيجة في القلوب التي هي متسعة أو مقيدة اعتمادا على ما إذا كانت تقمع أو تعزيز الميوسين وأتباز النشاط . لا تستطيع هذه الأنواع من القياسات تكون في الذباب على حالها كما هي عادة لا يمكن تحديد حواف القلب على طول الأنبوب القلب عن طريق بشرة والدهون ، (قارن Wildtype ، D45 وMhc5 M - أوضاع في "M - وضع الرقم "أدناه) التي تحيط عادة القلب. وتقتصر عادة القياسات التي أجريت عند تصور القلب في الذباب على حالها مع غيرها من الأساليب المستخدمة عادة في الجزء الأمامي من معظم القلب ، وغرفة المنطقة المخروطية. كما أنه ليس من الممكن الحصول على هذا القياس الحيوي في الأنسجة الثابتة.
2. الكشف عن الحركة
تتم هذه الخطوة تلقائيا من قبل البرنامج ويستخدم اثنين من خوارزميات مختلفة لتحليل الحركة في كل فيلم. لفترة وجيزة ، الخوارزمية الأولى ، "الظلام الثانية متوسط" يستخدم خوارزمية الإطار بواسطة نهج الإطار. هذه المعدلات الخوارزمية شدة الظلام لإطار الفيلم بأكمله ، ويسوي القيمة إلى الفاصل الزمني بين 0 و 1 ، والمؤامرات المتوسط لتطبيع كل إطار في الفيلم أكثر من مرة. النهج الثاني ، "بكسل بكسل" الخوارزمية ، ويحلل تغيير في الظلام من كل خلية فردية من إطار واحد إلى التالي. تتلخص بكسل الذي يحمل تغيرات كثافة أعلى من عتبة محددة مسبقا لكل إطار ، وخططت لكل إطار في الفيلم أكثر من مرة.
3. الاختيار فواصل -
يتم عرض الإخراج من خوارزميات الكشف عن اثنين في حركة هذه الوحدة مع "متوسط الظلام" الإخراج المعروضة في إطار فوق "بكسل بكسل" إطار الإخراج. من أجل أن تكون على يقين من أن الكشف عن فترات يتفق مع الحركة في الفيلم الفعلية التي نعرضها على حافة تعقب أو M - وضع مصنوعة من إطارات يجري تحليلها مباشرة تحت النوافذ الإخراج الخوارزمية. وأدلى M - الوضع عن طريق خفض رقميا شرائح واسعة من خلال بكسل واحد في القلب من كل إطار في الفيلم ومواءمتها أفقيا لتوفير لقطة من الحركات حافة القلب مع مرور الوقت. في "بكسل بكسل" نافذة يشار إلى الفترات المحددة الانبساطي بواسطة خط أفقي الخضراء مع عدد من الأطر التي تسهم في تلك الفترة أعلاه مباشرة. ويتم تحديد فترات الانقباضي والفاصل الزمني بين اثنين من الإنبساط المتعاقبة. يشار إلى بداية انقباض في وضع - M بواسطة خط عمودي والأزرق هو مبين في نهاية طريق خط أحمر عمودي. مع هذا العرض من السهل نسبيا لمعرفة ما إذا كان الإخراج الخوارزمية تتفق مع حركات القلب الفعلية.
يجب أن يتم إجراء الكشف على الرغم من أن الحركة تلقائيا يتم التحقق الإخراج للتأكد من دقتها. هناك عدة أسباب لذلك ، واحد هو أن هناك كثيرا ما الكامنة ، وتقلبات الموجة البطيئة في ضوء المستويات لا علاقة لحركة القلب. يمكن أن يتم القضاء على هذه العادة عن طريق استخدام المدمج في تصفية تمرير عالية. والسبب الثاني أن تفعل مع حساسية "بكسل بكسل" النهج. الإخراج من هذه الخوارزمية هو عادة يتتبع حركة اثنين ، واحد للحركة والتقلص واحد للحركة الاسترخاء. في كبار السن في بعض الذباب والمسوخ طول الفترة الزمنية بين هاتين الحركتين تصبح طويلة نسبيا ، وبرنامج يحاول تفسير الحركتين باعتبارهما يدق منفصلة. يمكن تصحيح هذا عن طريق طرح برنامج للمقارنة بين مخرجات بكسل بكسل مع الخوارزمية التي من الخوارزمية الثانية متوسط الظلام ، من خلال النقر على مربع "استخدم الظلام".
على سبيل المثال (راجع الفيديو) : و5-7 الاسبوع القديمة الذباب فترات الانقباضي وعادة ما تكون أطول بكثير مما كان عليه في الذباب الشباب. في البداية يتم الكشف عن هذه فترات طويلة عن اثنين من تقلصات منفصلة مفصولة انبساط قصيرة. يمكن تصحيح هذا عن طريق اختيار "استخدم الظلام" خانة الاختيار. في هذه الحالة سيقوم البرنامج مقارنة الفاصل الانبساطي التي حددها بكسل خوارزمية بكسل مع الإخراج الثانية متوسط الظلام. إذا كان الظلام الثانية متوسط الانتاج لديها قيمة موجبة ، ثم سيتم تجاهل أي الفاصلة الانبساطي المحددة في خوارزمية بكسل بكسل وسيتم تحديد الفواصل الزمنية بشكل صحيح. يمكن مسحها الفيلم بأكمله في 10 قطاعات الثانية وقبلت (انقر على زر "موافق بيانات") أو رفض (انقر على زر "تجاهل البيانات"). يمكن أن يكون مرحبا والحساسيات تمرير مرشح لو ضبطها يدويا للمساعدة في تحديد أدق فترات الانكماش عند استخدام الخوارزمية الظلام.
4. الإخراج الاحصاء
مرة واحدة وقد تم قبول الإخراج لفيلم معين سيقوم البرنامج استخدام هذه المعلومات لحساب تلقائيا عددا من المعلمات. وتشمل هذه الفترة الانبساطي والانقباضي ، وفترة القلب ومعدل ضربات القلب والتوجيه وسرعة من FS موجة الانكماش ، بأقطار القلب ، و٪. بالإضافة إلى ذلك ، أن البرنامج قد أساليب متعددة لقياس arrhythmicity يعكس انكماش غير موحدة ودورات الاسترخاء (انظر فينك وآخرون ، 2009). يتم توفير الإخراج الإحصائية عن كل فيلم على حدة وعلى مجموعة البيانات بالكامل في شكل قيمة مفصولة بفواصل (CSV) ملف التي يمكن فتحها في برامج جداول البيانات مثل Microsoft Excel.
الجدول 1 --
مثال الإخراج التي تم إنشاؤها بواسطة شبه الآلي برنامج التحليل البصري القلب.
5. تحديث المدرج الإحصائي.
هذا الجزء من البرنامج بعرض جميع البيانات الموجودة على فترات القلب لمجموعة البيانات في شكل رسم بياني. منذ معدل ضربات القلب ومتغير ونحن تطبيع بيانات الإخراج الرسم البياني. ومع ذلك ، لأن توزيع فترات ليست متماثلة حول يعني أننا نستخدم قيمة الفاصل الزمني وسيطة لتطبيع لدينا.
على سبيل المثال (راجع فيديو) : الذباب التي متحولة للقناة البوتاسيوم KCNQ تظهر عدم انتظام فترات غاية الانبساط والانقباض. عادة فترات أطول بكثير الانقباضي ومزيد من عدم انتظام مما كانت عليه في سن المطابقة wildtype الذباب. ويمكن رؤية ذلك بوضوح من خلال عرض البيانات في شكل رسم بياني (انظر أيضا Ocorr آخرون 2007).
6. M - اسطة
هذه الوحدة يولد M - أوضاع التي يمكن أن تكون مصنوعة من أي موقف على طول القلب في إطار الفيلم. ويمكن أيضا طول النمط - M تحددها. M - صيغ مفيدة لإظهار نوعيا ما يقوم به القلب في الفيلم.
على سبيل المثال (راجع فيديو) : الفيلم من قلب الزرد القديمة لمدة 3 أيام اليرقات تظهر البطين الأمامية التي يتم استخدامها لإنشاء M - وضع. يشار إلى شريحة الرأسي للخلية التي سيتم رفعه الكترونيا من كل إطار الفيلم بواسطة خط أحمر.
M - وضع الشكل : أمثلة من طراز M - سائط من ذبابة الفاكهة والزرد. واحدة من الطفرات التي تمت مناقشتها في الميوسين نتائج الخطوة Preprocess في المحركات الجزيئية مع حركية أسرع الانزيم مما يؤدي إلى تقييد القلب وأحيانا كتلة التوصيل. يمكن أن تظهر كل من المعلمات باستخدام نوعي M - وسائط. 
M - سائط المحرز في نفس الجزء من القلب في كل من wildtype والذباب متحولة تظهر بوضوح النمط الظاهري مقيد في متحولة 5 MHC وبأقطار المتوسعة ودورات الانكماش عدم اتساق نبضات القلب من متحولة D45 (الذي يعبر عن حركية إنزيم الميوسين مع الاكتئاب) (تعديل من Cammarato وآخرون 2008 ، AL).
M - وضع مصنوعة من قلب يرقات اسماك الزرد تبين البطين الأمامي (نفس الفيلم القلب كما هو موضح في التظاهرة ، فينك et.al. 2009).
7. النقطة الحمراء السينما
وتنتج هذه الوحدة تلقائيا تباطأ (1:4) ، 20 الإصدار الثاني من فيلم يظهر تحليل كل بكسل التي يتم تحديدها والمتغيرة في الحمراء. يتم استخدام هذه الميزة في المقام الأول لأغراض التوضيح.
الفيلم 1 -- A "فيلم نقطة حمراء" تظهر بكسل التي يتم تحديدها بأنها تغييرات شدة الظلام خوارزميات البرنامج في الحمراء. وتباطأت سرعة الفيلم الأصلي من قبل عامل من 4.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> اضغط هنا لتحميل الفيلم 1.
8. تطبيقات إضافية
بدأنا في تطبيق هذا النظام التحليلي لأفلام عالية السرعة من نماذج أخرى بقلوب الصغيرة التي غالبا ما يصعب تحليلها باستخدام المنهجية التقليدية. لقد طبقنا بنجاح هذا التحليل لقلوب كل من اليرقات الزرد والفأر الجنينية قلوب (فينك وآخرون ، 2009).
الفيلم 2 -- ماوس القلب بالإضافة إلى الفيلم شخصية مع فواصل تحقق مع إخراج البيانات.
انقر هنا لتحميل الفيلم 2. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد أثبت نموذج ذبابة الفاكهة إلى أن تكون أداة قوية الجينية التي تم استخدامها لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة العلمية التي تتراوح بين التنمية الجنينى على التعلم والذاكرة. وقد تم مؤخرا استخدام هذا النموذج الحي تنوعا للتحقيق في علم الوراثة وظيفة القلب. وقد اعتمد عدد من المحاولات لتحديد فسيولوجيا القلب في ذبابة الفاكهة الكبار على الملاحظات التي أبديت في الذباب سليمة من خلال بشرة البطن. معظم هذه الطرق تعتمد على الملاحظة البصرية أو تسجيلات للتغيرات في شدة الضوء ينتقل عن طريق البطن لتحديد معلمة واحدة ، معدل ضربات القلب. على الرغم من أن هذا هو المعلمة مفيدة هي محدودة في ما تخبرنا عن وظيفة القلب. لدينا شبه الآلي التحليل البصري نبضات الأسلوب هو نهج قوية لاستخلاص معلومات دقيقة حول عدد من المعالم الهامة إضافية من الأفلام عالية السرعة للضرب قلوب والقيام بذلك في كل نبضة في السجل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويتم دعم KO AC بمنحة وزمالة من جمعية القلب الاميركية. ويتم اعتماد الميزانية العادية SIB من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
