Summary
हम से उच्च गति ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करने के लिए एक अर्ध स्वचालित ऑप्टिकल हार्टबीट विश्लेषण विधि (सोहा) विकसित किया है
Abstract
हम से उच्च गति ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करने के लिए एक विधि विकसित की है
Protocol
अर्द्ध स्वचालित दिल की धड़कन विश्लेषण प्रक्रिया (सोहा) के एक सिंहावलोकन देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
अर्ध स्वचालित ऑप्टिकल दिल की धड़कन विश्लेषण
1. Preprocess -
इस कदम डायस्टोलिक और सिस्टोलिक दिल व्यास पर जानकारी प्रदान करता है है.
हार्ट किनारों की पहचान और अधिकतम पाद लंबा और प्रकुंचन के दौरान चिह्नित कर रहे हैं. ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग धीमी गति और यहाँ तक कि एक फ्रेम की सटीक पहचान है जहां अधिक से अधिक और हृदय के संकुचन और विश्राम होते अनुमति समय में एक फ्रेम पर उन्नत किया जा सकता है है. डायस्टोलिक किनारों और एक जोड़ी सिस्टोलिक किनारों की पहचान की पहचान के निशान से एक जोड़ी बना रहे हैं. मार्क्स भी दिल के साथ विभिन्न क्षैतिज स्थानों पर दो प्रतियों में बनाया जा सकता है.
दिल इस चरण में प्राप्त व्यास को भी एक अतिरिक्त माप है कि दिल की सिकुड़ना के एक अनुमान प्रदान करता है की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. इस उपाय प्रतिशत भिन्नात्मक छोटा (% एफएस) है और यह हद है जो दिल के किनारों एक संकुचन के दौरान एक दूसरे की ओर कदम का प्रतिनिधित्व करता है. % एफएस की गणना के लिए इस्तेमाल किया सूत्र है:
(((Diastolic व्यास - सिस्टोलिक व्यास) / Diastolic व्यास) x 100)
नोट - इस सेट में पहचान अंक केवल व्यास और भिन्नात्मक छोटा माप के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और आंदोलन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं.
उदाहरण: (. Cammarato, एट अल 2008) ड्रोसोफिला में बिंदु उत्परिवर्तन मायोसिन भारी है श्रृंखला transducer डोमेन में, एक में जाना जाता है क्षेत्र है मोटर enzymatic गतिविधि, दिल है कि फैली हुई या कर रहे हैं कि क्या वे दबाने या है मायोसिन ATPase गतिविधि बढ़ाने पर निर्भर करता है प्रतिबंधित में परिणाम मिलाना करने के लिए . माप के इन प्रकार बरकरार मक्खियों में नहीं बनाया के रूप में यह आमतौर पर छल्ली और वसा के माध्यम से दिल ट्यूब की पूरी लंबाई के साथ दिल के किनारों की पहचान संभव नहीं कर सकते हैं (wildtype तुलना, D45 और Mhc5 एम "एम मोड में मोड "नीचे चित्र), जो आम तौर पर दिल के चारों ओर. बना जब अन्य सामान्य रूप से नियोजित तरीके के साथ बरकरार मक्खियों में दिल visualizing माप आमतौर पर दिल के सबसे पूर्वकाल भाग, चोटीदार चैम्बर क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं. यह भी तय ऊतकों में इस गतिशील माप प्राप्त करना संभव नहीं है.
2. आंदोलन जांच
यह कदम प्रोग्राम द्वारा स्वचालित रूप से किया जाता है और दो अलग अलग एल्गोरिदम का उपयोग करता है के लिए प्रत्येक फिल्म में आंदोलन का विश्लेषण. संक्षेप में, पहली एल्गोरिथ्म, "औसत फ़्रेम डार्कनेस" एल्गोरिथ्म फ्रेम दृष्टिकोण से एक फ्रेम का उपयोग करता है. इस एल्गोरिथ्म एक पूरी फिल्म फ्रेम के लिए अंधेरे की तीव्रता औसत, 0 और 1 के बीच एक अंतराल के मूल्य normalizes, और समय के साथ फिल्म में हर फ्रेम के लिए सामान्यीकृत औसत भूखंडों. दूसरा दृष्टिकोण, "पिक्सेल द्वारा पिक्सेल" एल्गोरिथ्म, एक फ्रेम से अगले करने के लिए सभी व्यक्तिगत पिक्सल के अंधेरे में परिवर्तन का विश्लेषण करती है. पिक्सेलस है कि एक पूर्व निर्धारित सीमा से ऊपर तीव्रता परिवर्तन एक्ज़िबिट प्रत्येक फ्रेम के लिए अभिव्यक्त कर रहे हैं और समय के साथ फिल्म में हर फ्रेम के लिए प्लॉट किए जाते हैं.
3. अंतराल की जाँच करें
"औसत डार्कनेस" उत्पादन खिड़की "पिक्सेल द्वारा पिक्सेल" ऊपर एक खिड़की में प्रदर्शित उत्पादन के साथ दो आंदोलन का पता लगाने एल्गोरिदम से उत्पादन में इस मॉड्यूल में प्रदर्शित होता है. आदेश में यकीन है कि पता लगाने के अंतराल वास्तविक फिल्म हम एक बढ़त का पता लगाने या एम - मोड एल्गोरिथ्म उत्पादन खिड़कियों के नीचे सीधे विश्लेषण किया जा रहा है फ्रेम से बना प्रदर्शन में आंदोलन के साथ सहमत हो. एम - मोड डिजिटल स्लाइस दिल के माध्यम से एक व्यापक पिक्सेल काटने और फिल्म में प्रत्येक फ्रेम से उन्हें क्षैतिज aligning समय पर दिल बढ़त आंदोलनों का एक स्नैपशॉट प्रदान किया जाता है. "पिक्सेल द्वारा पिक्सेल" विंडो में पहचान डायस्टोलिक अंतराल कि अंतराल को सीधे ऊपर योगदान फ्रेम की संख्या के साथ एक क्षैतिज ग्रीन लाइन द्वारा संकेत कर रहे हैं. सिस्टोलिक अंतराल लगातार दो diastoles के बीच अंतराल के रूप में पहचाने जाते हैं. प्रकुंचन की शुरुआत एम मोड में एक ऊर्ध्वाधर ब्लू लाइन ने संकेत दिया है और अंत में एक खड़ी लाल रेखा ने संकेत दिया है. इस प्रदर्शन के साथ यह अपेक्षाकृत आसान है देखने के लिए अगर एल्गोरिथ्म उत्पादन वास्तविक दिल आंदोलनों के साथ सहमत हैं.
हालांकि आंदोलन का पता लगाने स्वचालित रूप से किया जाता है उत्पादन सटीकता के लिए जाँच की जानी चाहिए. इस के लिए कई कारण हैं, एक यह है कि वहाँ अक्सर एक अंतर्निहित, प्रकाश दिल आंदोलन करने के लिए संबंधित नहीं स्तर में धीमी गति से लहर उतार - चढ़ाव है. यह आमतौर पर उच्च पास फिल्टर में बनाया के उपयोग के द्वारा समाप्त किया जा सकता है. एक दूसरा कारण यह दृष्टिकोण "पिक्सेल द्वारा पिक्सेल" की संवेदनशीलता के साथ करना है. इस एल्गोरिथ्म से उत्पादन आम तौर पर दो आंदोलन निशान, और संकुचन आंदोलन के लिए एक छूट आंदोलन के लिए है. पुराने मक्खियों में है और कुछ म्यूटेंट में समय की लंबाई इन दो आंदोलनों के बीच अपेक्षाकृत लंबा हो जाता है और कार्यक्रम के लिए दो अलग धड़कन के रूप में दो आंदोलनों की व्याख्या करने का प्रयास करता है. इस कार्यक्रम पूछ पिक्सेल कलन विधि द्वारा औसत फ़्रेम अंधेरे एल्गोरिथ्म के साथ कि पिक्सेल के उत्पादन की तुलना द्वारा सुधारा जा सकता है "अंधेरे का प्रयोग करें" बॉक्स पर क्लिक करके.
(वीडियो देखें) उदाहरण: 5 से 7 पुरानी सप्ताह में मक्खियों सिस्टोलिक अंतराल आम तौर पर कर रहे हैं बहुत युवा मक्खियों की तुलना में अब . ये लंबे अंतराल के शुरू में एक छोटी पाद लंबा द्वारा दो अलग अलग संकुचन के रूप में पता चला रहे हैं. इस "अंधेरे का प्रयोग करें" चेक बॉक्स का चयन द्वारा सुधारा जा सकता है. इस मामले में कार्यक्रम डायस्टोलिक द्वारा पिक्सेल द्वारा पिक्सेल एल्गोरिथ्म औसत फ़्रेम अंधेरे उत्पादन के साथ की पहचान अंतराल की तुलना करेंगे. यदि औसत फ़्रेम अंधेरे उत्पादन एक धनात्मक मान है, तो किसी भी diastolic पिक्सेल एल्गोरिथ्म द्वारा पिक्सेल में अंतराल की पहचान की और उपेक्षा हो जाएगा अंतराल सही ढंग से निर्दिष्ट किया जाएगा. पूरी फिल्म 10 सेकंड क्षेत्रों में स्कैन किया जा सकता है और स्वीकार किए जाते हैं (क्लिक करें "डेटा ठीक है") या अस्वीकार कर दिया (क्लिक करें "डेटा त्यागें"). हाय और लो गुजारें फिल्टर संवेदनशीलता अधिक सही मदद संकुचन अंतराल को परिभाषित जब अंधेरे एल्गोरिथ्म रोजगार मैन्युअली समायोजित कर सकते हैं.
4. आउटपुट सांख्यिकी
एक बार एक भी फिल्म के लिए उत्पादन में स्वीकार किया गया है प्रोग्राम है कि जानकारी का उपयोग करने के लिए स्वचालित रूप से मानकों की एक संख्या की गणना करेगा. ये अंतराल डायस्टोलिक और सिस्टोलिक, दिल अवधि और दिल की दर, दिशा और संकुचन की लहर, दिल, व्यास, और% एफएस के वेग में शामिल हैं. इसके अलावा, इस कार्यक्रम के गैर वर्दी संकुचन और विश्राम चक्र (गुप्तचर एट अल, 2009) को दर्शाती arrhythmicity बढ़ाता के लिए कई तरीके है. सांख्यिकीय उत्पादन प्रत्येक व्यक्तिगत फिल्म के लिए और पूरे एक कॉमा सेपरेटेड वैल्यू (. Csv) फ़ाइल के रूप जो Microsoft एक्सेल जैसे स्प्रेडशीट प्रोग्राम्स में खोला जा सकता है है में डेटा सेट के लिए प्रदान की जाती है.
तालिका 1 -
अर्ध स्वचालित ऑप्टिकल हार्ट विश्लेषण प्रोग्राम द्वारा उत्पन्न उत्पादन का एक उदाहरण है.
5. अद्यतन - Histograms
कार्यक्रम के इस हिस्से हिस्टोग्राम प्रारूप में एक डाटासेट के लिए दिल के अंतराल पर डेटा के सभी प्रदर्शित करता है. के बाद से दिल की दर चर रहे हैं हम हिस्टोग्राम आउटपुट डेटा मानक के अनुसार. हालांकि, क्योंकि अंतराल के वितरण के चारों ओर एक सममित नहीं है मतलब है कि हम हमारे सामान्य के लिए बीच का अंतराल मूल्य का उपयोग करें.
उदाहरण (वीडियो देखें): मक्खियों कि KCNQ पोटेशियम चैनल के लिए उत्परिवर्ती हैं बेहद अनियमित डायस्टोलिक और सिस्टोलिक अंतराल बताते हैं. आमतौर पर सिस्टोलिक अंतराल ज्यादा और उम्र से मिलान wildtype मक्खियों की तुलना में अनियमित हैं. हिस्टोग्राम स्वरूप में डेटा प्रदर्शित करके यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है (यह भी देख Ocorr एट अल 2007.).
6. एम - मोड -
इस मॉड्यूल उत्पन्न करता है कि एम - मोड फिल्म फ्रेम में दिल के साथ किसी भी स्थिति से बनाया जा सकता है. एम - मोड की लंबाई भी निर्दिष्ट किया जा सकता है. एम - मोड गुणात्मक दिखाने के लिए एक फिल्म में दिल क्या कर रहा है के लिए उपयोगी होते हैं.
(वीडियो देखें) उदाहरण: एक दिन में 3 पुराने zebrafish लार्वा पूर्वकाल वेंट्रिकल है कि एक एम - मोड उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है दिखा रहा है दिल की मूवी. पिक्सल के ऊर्ध्वाधर टुकड़ा है कि इलेक्ट्रॉनिक प्रत्येक फिल्म फ्रेम से excised जाएगा एक लाल रेखा द्वारा दर्शाया जाता है.
एम - मोड चित्रा: ड्रोसोफिला और zebrafish से एम मोड के उदाहरण. मायोसिन तेजी एंजाइम कैनेटीक्स दिल प्रतिबंध में जिसके परिणामस्वरूप और कभी कभी एक चालन ब्लॉक के साथ एक आणविक मोटर में preprocess कदम परिणामों में चर्चा म्यूटेशनों. दोनों मापदंडों गुणात्मक एम मोड का उपयोग कर दिखाया जा सकता है है. 
दोनों wildtype और उत्परिवर्ती मक्खियों के हृदय में एक ही हिस्से में बने एम मोड स्पष्ट रूप से MHC 5 उत्परिवर्ती और फैली हुई diameters और उत्परिवर्ती D45 (जो उदास एंजाइम कैनेटीक्स के साथ मायोसिन व्यक्त) के अतालता संकुचन चक्र में प्रतिबंधित phenotype दिखाने ( संशोधित Cammarato एट अल 2008, से).
Zebrafish लार्वा पूर्वकाल वेंट्रिकल (वही दिल फिल्म के रूप में प्रदर्शन, गुप्तचर 2009 et.al. में दिखाया गया है) दिखा दिल से बनाया एम मोड.
7. लाल डॉट मूवी -
इस मॉड्यूल को स्वचालित रूप से एक धीमा (1:4), एक विश्लेषण फिल्म सभी पिक्सल है कि लाल रंग में बदलने के रूप में पहचान कर रहे हैं दिखाने के 20 दूसरे संस्करण पैदा करता है. यह सुविधा मुख्य रूप से चित्रण प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया है.
1 मूवी - एक "लाल डॉट फिल्म" पिक्सल है कि लाल रंग में कार्यक्रम एल्गोरिदम द्वारा अंधेरे तीव्रता में परिवर्तन होने के रूप में पहचाने जाते हैं दिखा. फिल्म गति मूल से 4 का एक कारक द्वारा धीमा है.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> 1 मूवी डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
8. अतिरिक्त अनुप्रयोगों
हम अन्य मॉडलों के उच्च गति फिल्मों के लिए छोटे दिल जो अक्सर मुश्किल कर रहे हैं पारंपरिक पद्धति का उपयोग विश्लेषण के साथ इस विश्लेषणात्मक प्रणाली लागू करने के लिए शुरू कर दिया है. हम सफलतापूर्वक दोनों zebrafish लार्वा दिल और भ्रूण माउस दिल (गुप्तचर एट अल, 2009) के लिए इस विश्लेषण लागू होता है.
2 मूवी - माउस दिल फिल्म से अधिक डेटा निर्गम के साथ चेक अंतराल के साथ आंकड़े.
2 मूवी डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ड्रोसोफिला मॉडल के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण है कि वैज्ञानिक embryological विकास से सीखने और स्मृति को लेकर सवालों की एक किस्म का पता करने के लिए इस्तेमाल किया गया है साबित हो गया है. हाल ही में इस बहुमुखी मॉडल जीव दिल समारोह की आनुवांशिकी की जांच इस्तेमाल किया गया है. वयस्क ड्रोसोफिला में दिल फिजियोलॉजी यों के प्रयास का एक संख्या पेट छल्ली के माध्यम से बरकरार मक्खियों की गई टिप्पणियों पर भरोसा है. इन तरीकों के अधिकांश दृश्य प्रेक्षण या पेट के माध्यम से प्रेषित करने के लिए एक एकल पैरामीटर, हृदय की दर यों प्रकाश की तीव्रता में परिवर्तन की रिकॉर्डिंग पर निर्भर करते हैं. हालांकि यह एक उपयोगी पैरामीटर है क्या यह हमारे दिल समारोह के बारे में बताता है सीमित है. हमारे अर्ध स्वचालित ऑप्टिकल हार्टबीट विश्लेषण विधि दिल की धड़कन की उच्च गति फिल्मों से अतिरिक्त महत्वपूर्ण पैरामीटर की एक संख्या के बारे में सटीक जानकारी पाने और एक रिकार्ड में हर दिल की धड़कन के लिए ऐसा करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
को और एसी और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से एक फैलोशिप अनुदान द्वारा समर्थित हैं. एसआईबी और आरबी NIH से अनुदान द्वारा समर्थित हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
