Summary
פיתחנו חצי אוטומטיות Heartbeat אופטי ניתוח בשיטה (סוהא) לניתוח הקלטות מהירות גבוהה אופטי מ
Abstract
פיתחנו שיטה לניתוח הקלטות מהירות גבוהה אופטי מ
Protocol
לחץ כאן כדי להציג סקירה של ההליך חצי אוטומטיות ניתוח (סוהא) דופק.
חצי אוטומטיות דופק אופטי ניתוח
1. Preprocess -
צעד זה מספק מידע על בקטרים לב סיסטולי ודיאסטולי ו.
שולי לב מזוהים ומסומנים במהלך דיאסטולה התכווצות מקסימלית. הקלטות אופטי ניתן מתקדמת במהירות איטית אפילו מסגרת אחת בכל פעם, המאפשר זיהוי מדויק של מסגרות שבו התכווצות הרפיה מירבית של הלב להתרחש. זוג אחד של סימני זיהוי קצוות הדיאסטולי וזוג אחד לזהות את הקצוות סיסטולי נעשים. מרקס יכול גם להתבצע לשכפל במקומות שונים לאורך אופקי הלב.
בקטרים הלב שהושגו בשלב זה משמשים גם כדי לחשב מדידה נוסף המספק אומדן contractility הלב. צעד זה הוא קיצור אחוזים חלקיים (% FS) והוא מייצג את המידה בה את הקצוות לב לנוע לכיוון אחד את השני במהלך התכווצות. הנוסחה המשמשת לחישוב FS% הוא:
(((בקוטר הדיאסטולי - קוטר הסיסטולי) / בקוטר הדיאסטולי) x 100)
הערה - נקודות לזהות קבוצה זו משמשים רק בקוטר מדידות קיצור חלקיים ולא משמשים לזיהוי תנועה.
דוגמה: (. Cammarato, et al 2008) ב תסיסנית, מוטציות נקודתיות בתחום מתמר שרשרת שרירן כבד, אזור הידוע לווסת את הפעילות האנזימטית של המנוע, התוצאה בלב כי הם מורחבים או מוגבלת בהתאם אם הם לדכא או לשפר ATPase של שרירן פעילות . סוגים אלה של מדידות לא יכול להתבצע זבובים שלם כפי שהוא בדרך כלל לא ניתן לזהות קצוות לב לכל אורך הצינור לב דרך לציפורן לבין שומן, (השוו Wildtype, D45 ו Mhc5 M-מצבי "M-mode איור "להלן) אשר בדרך כלל מקיפים את הלב. מדידות שנעשו כאשר לדמיין את הלב אצל זבובי שלם עם השיטות הננקטות בדרך כלל אחרים מוגבלים בדרך כלל לחלק הקדמי ביותר של הלב, באזור תא חרוטי. זה גם לא ניתן להשיג מדידה דינמית ברקמות קבוע.
2. התנועה איתור-
צעד זה נעשה באופן אוטומטי על ידי התוכנית משתמשת בשני אלגוריתמים שונים כדי לנתח את התנועה בסרט אחד. בקיצור, האלגוריתם הראשון, "מסגרת ממוצע וחושך" אלגוריתם משתמשת מסגרת מסגרת על ידי גישה. זה ממוצעים אלגוריתם עוצמת חושך מסגרת סרט שלם, מנרמל את הערך מרווח בין 0 ל -1, ומגרשים הממוצע מנורמל עבור כל מסגרת בסרט לאורך זמן. הגישה השנייה, את "פיקסל פיקסל על ידי" אלגוריתם, מנתחת את השינוי החושך של כל פיקסלים בודדים ממסגרת אחת לאחרת. פיקסלים כי התערוכה שינויים בעוצמה מעל סף שנקבע מראש מסוכמים עבור כל מסגרת ו זממו עבור כל מסגרת בסרט לאורך זמן.
3. בדוק מרווחי-
הפלט משני אלגוריתמים לזיהוי תנועה מוצג מודול זה עם פלט "ממוצע וחושך" מוצג בחלון מעל "פיקסל בפיקסל" חלון הפלט. על מנת להיות בטוח כי מרווחי זיהוי מסכים עם התנועה בסרט בפועל אנו מציגים יתרון-זכר או M-mode עשה מן המסגרות להיות מנותח ישירות מתחת לחלונות פלט האלגוריתם. M-mode נעשית על ידי חיתוך פרוסות דיגיטלית ברוחב פיקסל אחד דרך הלב של כל מסגרת בסרט והתאמת אותם אופקית כדי לספק תמונת מצב של קצה תנועות הלב לאורך זמן. ב "פיקסל בפיקסל" חלון במרווחים הדיאסטולי מזוהה מסומנים על ידי קו אופקי ירוק עם מספר מסגרות לתרום מרווח ישירות מעל. מרווחי הסיסטולי מזוהים מרווח בין שני diastoles רצופים. ההתחלה של התכווצות מצוין במצב-M על ידי קו כחול אנכי, ואת הקצה מסומן על ידי קו אדום אנכי. עם צג זה קל יחסית לראות אם הפלט אלגוריתם מסכים עם תנועות הלב בפועל.
למרות זיהוי התנועה מתבצע באופן אוטומטי פלט חייב להיבדק על הדיוק. ישנן מספר סיבות לכך: אחת היא שיש לעתים קרובות תנודות הבסיסית, גל איטי ברמות אור לא קשור לתנועה לב. בדרך כלל ניתן לבטל על ידי שימוש במסנן בנה לעבור גבוהה. סיבה שנייה קשורה לרגישות של "פיקסל בפיקסל" הגישה. פלט האלגוריתם הזה הוא בדרך כלל two עקבות תנועה, אחת לכל תנועת התכווצות ואחד התנועה הרפיה. ב זבובים ישנים ב מוטנטים כמה משך הזמן בין שתי התנועות הופך להיות ארוך יחסית התוכנית מנסה לפרש את שתי התנועות כשתי פעימות נפרדות. זה ניתן לתקן על ידי לשאול את תוכנית להשוות את הפלט של פיקסל על ידי אלגוריתם פיקסל עם זה של האלגוריתם פריים ממוצע חושך, על ידי לחיצה על תיבת "השתמש חושך".
דוגמה (ראה וידאו): בשבוע 5-7 הישן הזבובים במרווחים הסיסטולי הם בדרך כלל הרבה יותר מאשר אצל זבובי צעירים. מרווחי זמן אלה מזוהים בתחילה כמו שני צירים נפרדים המופרדים דיאסטולה קצר. זה ניתן לתקן על ידי בחירת "חושך שימוש" תיבת הסימון. במקרה זה התוכנית יהיה להשוות את מרווח הדיאסטולי שזוהו על ידי Pixel על ידי אלגוריתם פיקסל עם הפלט מסגרת ממוצע החושך. אם התפוקה הממוצעת חושך מסגרת בעלת ערך חיובי, אז מרווח כלשהו הדיאסטולי שזוהו על ידי אלגוריתם פיקסל פיקסל תתעלם ואת מרווחי יפורטו כראוי. הסרט כולו ניתן לסרוק 10 קטעים השני קיבל (לחץ על "נתונים על אישור") או לדחות (לחץ על "מחק נתונים"). היי ורגישויות Lo לעבור מסנן ניתן להתאימם באופן ידני כדי לסייע באופן מדויק יותר להגדיר מרווחי התכווצות כאשר העסקת אלגוריתם החושך.
4. פלט לסטטיסטיקה,
לאחר פלט עבור סרט נתון התקבל התוכנית יהיה להשתמש במידע זה כדי לחשב באופן אוטומטי מספר פרמטרים. אלה כוללים מרווח הסיסטולי והדיאסטולי ו, פרק לב קצב הלב, כיוון ומהירות של FS גל התכווצות, בקטרים לב,%. בנוסף, התוכנית כוללת מספר שיטות לכימות arrhythmicity המשקף לא אחידה התכווצות מחזורי הרפיה (ראה פינק et al, 2009). פלט סטטיסטיים מסופק כל סרט בנפרד עבור הנתונים כולו להגדיר בצורה של ערך מופרד בפסיק (. Csv) אשר ניתן לפתוח תוכניות גיליון אלקטרוני כגון Microsoft Excel.
לוח 1 -
דוגמה הפלט שנוצר על ידי תוכנית חצי אוטומטיות אופטיות ניתוח לב.
5. עדכון Histograms-
חלק זה של התוכנית מציגה את כל הנתונים על מרווחי לב עבור בסיס הנתונים בפורמט היסטוגרמה. מאז קצב הלב משתנה ואנחנו לנרמל את נתוני התפוקה היסטוגרמה. עם זאת, כי חלוקת רווחי אינו סימטרי סביב ממוצע נשתמש ערך המרווח הממוצע לנורמליזציה שלנו.
דוגמה (ראה וידאו): זבובים כי הם מוטנטים ערוץ אשלגן KCNQ להראות במרווחים הסיסטולי והדיאסטולי ואת סדיר מאוד. בדרך כלל את המרווחים הסיסטולי הם הרבה יותר סדיר יותר מאשר בגיל בהתאמה זבובים wildtype. זה יכול להיראות בבירור על ידי הצגת הנתונים בתבנית היסטוגרמה (ראה גם Ocorr et al. 2007).
6. M-mode-
מודול זה מייצר M-מצבי שיכולה להתבצע מתוך עמדה לאורך כל הלב במסגרת הסרט. אורכו של מצב-M יכול להיות גם מוגדר. M-מצבי מועילים כדי להראות איכותית מה הלב עושה בסרט.
דוגמה (ראה וידאו): סרט של הלב 3 יום דג הזברה הישן הזחל מראה את החדר הקדמי המשמש ליצור M-mode. פרוסה אנכי של פיקסלים זה יהיה נכרת אלקטרונית ממסגרת כל סרט מצוין על ידי קו אדום.
M-mode איור: דוגמאות של M-מצבי מ תסיסנית ו דג הזברה. אחת המוטציות שרירן דנו בתוצאות צעד Preprocess ב מנוע מולקולרי עם קינטיקה האנזים מהיר יותר וכתוצאה מכך הגבלה הלב ומדי פעם בלוק הולכה. פרמטרים אלו יכולים להיות מוצגים איכותית באמצעות M-מצבי. 
M-מצבי עשה בחלק זהה של הלב ב wildtype וגם זבובים מוטנטיים מראים בבירור את הפנוטיפ הוגבלה MHC 5 מוטציה לבין בקטרים מורחבים מחזורי ההתכווצות arrhythmic של D45 מוטציה (המבטא שרירן עם קינטיקה אנזים מדוכא) (שונה מ Cammarato et. al, 2008).
M-mode עשוי מלב הזחל דג הזברה מראה את החדר הקדמי (קולנוע לב כמו שמוצג ההפגנה, פינק et.al. 2009).
7. Red Dot-Movie
מודול זה מייצר באופן אוטומטי האט (01:04), 20 הגירסה השנייה של הסרט מראה ניתחו את כל הפיקסלים המזוהות שינוי באדום. תכונה זו משמשת בעיקר לצורכי המחשה.
סרט 1 - "סרט נקודה אדומה" מראה את פיקסלים כי מזוהים כבעלי עוצמת השינויים חושך ידי אלגוריתמים תוכנית באדום. מהירות הסרט היא האטה מהמקור בפקטור של 4.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> לחץ כאן כדי להוריד סרט 1.
8. יישומים נוספים,
התחלנו ליישם את מערכת אנליטי סרטים במהירות גבוהה של דגמים אחרים עם לבבות קטנים אשר לעתים קשה לנתח באמצעות המתודולוגיה המסורתית. יש לנו מיושם בהצלחה את הניתוח הזה על שני לבבות הזחל דג הזברה ולבבות עכבר עובריים (פינק et al, 2009).
סרט 2 - לב עכבר הסרט פלוס דמות עם מרווחי לבדוק עם פלט נתונים.
לחץ כאן כדי להוריד סרט 2. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המודל תסיסנית הוכיחה להיות כלי רב עוצמה גנטי, שבו נעשה שימוש כדי לענות על מגוון שאלות מדעיות החל ההתפתחות העוברית על למידה וזיכרון. לאחרונה אורגניזם מודל זה צדדי נעשה שימוש כדי לחקור את הגנטיקה של תפקוד הלב. מספר נסיונות לכמת הפיזיולוגיה הלב המבוגר תסיסנית הסתמכו על תצפיות שנעשו באמצעות זבובים שלם לציפורן הבטן. רוב הגישות הללו תלויות תצפית ויזואלית או הקלטות של שינויים בעוצמת האור המועבר דרך הבטן לכמת פרמטר אחד, קצב הלב. למרות זאת הוא פרמטר שימושי הוא מוגבל מה זה אומר לנו על תפקוד הלב. חצי אוטומטיות ניתוח אופטי שלנו שיטת Heartbeat היא גישה חזקים הנובעים מידע מדויק על מספר פרמטרים חשובים נוספים מתוך סרטים במהירות גבוהה של לבבות פועמים וכדי לעשות זאת עבור כל פעימת לב ברשומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ק.א. ו-AC נתמכים על ידי מענק ו מלגה מאיגוד הלב האמריקני. SIB ו RB הם נתמך על ידי מענקים NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
