Summary
我们已经开发了一个半自动化光学检测信号分析方法（所下分析高速光学录音）
Abstract
我们已经开发出一种用于分析高速光学录音方法
Protocol
半自动光学心跳分析
1。预处理 -
这一步提供舒张压和收缩压的心直径的信息。
心脏边缘识别和标记在最大的舒张和收缩。光学录音，可先进的速度缓慢，甚至在时间允许的最大收缩和放松的心发生的帧精确识别帧。一双识别舒张边缘和一对确定收缩压边缘的商标之一。商标也可一式两份，在不同的水平位置，沿心脏。
在此步骤中获得的心脏直径也用于计算一个额外的测量提供了一个心脏的收缩力的估计。这项措施是％，短轴缩短率（％FS），它代表了心脏边缘，朝对方移动过程中收缩程度。 ％FS用来计算公式是：
（（（舒张末期内径 - 收缩直径）/舒张末期内径）× 100）
注 - 在此设置确定该点仅用于直径和缩短分数测量，不使用移动检测。
例 ：（。Cammarato，等2008）在果蝇中，肌球蛋白重链的传感器域点突变，一个地区的已知来调节电机的酶的活性，结果在心中，是扩张或限制取决于是否他们抑制或增强肌球蛋白的ATP酶活性的活动时。这些类型的测量不能完整的苍蝇，因为它是通常没有可能沿的心管通过的角质层和脂肪的整个长度的心边，（比较野生型，D45和Mhc5“中号的模式中号的模式图“下面），通常环绕的心。测量可视化与其他普遍采用的方法在完整的苍蝇的核心时，通常仅限于心脏的最前部分，锥形腔地区。它也不可能获得这个固定的组织中的动态测量。
2。移动检测
这一步是自动完成的程序和使用两种不同的算法来分析每部电影的运动。简单地说，第一种算法，“平均帧黑暗”算法使用一帧一帧的方法。该算法平均为整个电影框架的黑暗强度，规范化的值0和1之间的时间间隔，随着时间的推移电影的每一帧图正常化平均。第二种方法，“像素”的算法，分析了在黑暗中的所有单个像素从一帧到下一变化。像素，表现出强度超过预设的阈值的变化概括为每个帧，并随着时间的推移电影的每一帧绘制。
3。检查间隔
从两个运动检测算法的输出是“平均黑暗”在上面的输出窗口中的“像素”窗口显示的输出显示在此模块。为了确保检测的时间间隔与运动同意，在实际的电影，我们显示边缘跟踪或M模式，直接在下面分析该算法的输出窗口的帧。 M型是由数字切割片，通过心脏的一个像素宽在电影的每一帧，并调整水平提供的心随着时间的推移，边缘运动的快照。窗口中的“像素”所确定的舒张间隔上方促进该时间间隔的帧的数量与水平的绿线表示。收缩期间隔时间被确定为两个连续diastoles之间的时间间隔。收缩的开始，是一个垂直的蓝线表示在M模式，到底是由一个红色的垂直线表示。有了这个显示，它是比较容易看到算法的输出，如果同意与实际的心脏运动。
虽然运动检测是自动执行的输出必须检查的准确性。有几个原因之一是，往往有一个潜在的，在不相关的心脏运动的光线水平慢波波动。这通常可以使用一个内置的高通滤波器消除。第二个原因与灵敏度的“像素”像素“的方针。从这种算法的输出通常是两个运动的痕迹，收缩运动和放松运动之一。这两个运动之间的时间长度在年纪较大的苍蝇和一些突变体变得比较长，程序试图解释为两个单独的节拍的两个动作。可以纠正这种情况，提出的方案，比较像素的输出像素算法的平均帧黑暗算法，通过点击“使用黑暗”框中。
范例（见视频）：在5至7周龄苍蝇收缩间隔通常是更长的时间比在年轻的苍蝇。最初发现这些长的时间间隔短的舒张分离的两个独立的收缩。可以纠正这种情况，选择“使用黑暗”复选框。在这种情况下，程序将比较舒张间隔的平均帧黑暗输出像素与像素算法确定。如果平均帧黑暗输出具有积极的价值，那么任何舒张间隔像素像素算法确定将被忽略，并且将正确地指定的时间间隔。整个影片可以在10秒段扫描，并接受（点击“数据行”）或拒绝（点击“丢弃数据”）。 HI和LO通过过滤器的灵敏度可手动调整，以帮助更准确地定义收缩的间隔时，用人黑暗的算法。
4。产量统计
一旦已被接受为一个给定的影片的输出程序将使用这些信息自动计算参数的数量。这些措施包括收缩压和舒张压的时间间隔，心脏病期和心率，方向和速度的收缩波，心脏直径，和％FS。此外，该计划已量化arrhythmicity反映非均匀的收缩和舒张周期（见芬克等，2009）的多种方法。统计输出是单独为每部电影和整个数据形成一个逗号分隔值（CSV）文件，如Microsoft Excel电子表格程序，可在打开的设置。
表1 -
半自动化光学心脏分析程序生成的输出的一个例子。
5。更新直方图;
这部分的程序对心脏间隔的数据显示直方图格式的数据集。由于心脏率是可变的的，我们直方图的输出数据正常化。然而，因为间隔的分布是不围绕着对称的意思是我们用我们正常化的时间间隔中位数值。
示例（见视频）：KCNQ钾离子通道突变的果蝇表现出极不规则的舒张压和收缩压的时间间隔。通常情况下收缩间隔更长的时间，超过年龄相匹配的野生型果蝇的不规则。可以清楚地看出这显示直方图格式的数据（也看到Ocorr等。2007年）。
6。 M模式
此模块产生的M -模式，可从任何位置沿动画帧的心脏。还可以指定长度的M -模式。 M -模式是很有用的显示质心在电影做。
范例（见视频）：3天的斑马鱼幼体显示前心室的心，是用来产生一个M -模式的电影。将电子从每部电影帧切除像素的垂直切片显示一条红线。
M型图 ：从果蝇和斑马鱼的M -模式的例子。与更快的酶，从而导致心脏限制动力学和偶尔传导阻滞的分子马达的预处理步骤结果讨论了肌球蛋白基因突变。这两个参数可使用M -模式显示定性。 
在野生型和突变的果蝇的心脏在同一部分的M -模式清楚地显示在MHC 5突变体和扩张的直径和D45突变（对酶动力学低迷的肌球蛋白）心律失常收缩周期限制的表型（修改从Cammarato等人，2008年）。
M模式从斑马鱼幼虫前心室的心脏（同样的心的电影，在演示中，芬克等人2009所示）。
7。红点电影
这个模块会自动产生一个放缓（1:4），20的分析显示，在红色改变标识的所有像素的影片的第二个版本。此功能主要是用于说明目的。
电影1 -一个“红点电影”显示，有红色的程序算法的黑暗强度的变化来确定的像素。影片从原来的4倍的速度放缓。
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi“>点击这里下载电影1。
8。额外的应用程序
我们已经开始了这一分析系统，适用于小的心，这是经常使用传统方法难以分析其他型号的高速动画。我们已经成功地应用这一分析的斑马鱼的幼体心中胚胎小鼠心脏（芬克等人，2009年）。
电影2 -小鼠心脏电影加数字数据输出的检查间隔。
点击这里下载电影2。 
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Discussion
果蝇模型已被证明是一个强大的遗传工具，已经被用来解决各种科学问题，从胚胎发育，学习和记忆不等。最近这种多功能的模式生物用于研究心脏功能的基因。一些试图量化在成年果蝇的心脏生理依赖于完整的苍蝇经腹角质层的意见。这些方法大多依靠目视观察，或通过腹部量化一个参数，心率传输光的强度变化的录音。虽然这是一个有用的参数，它是有限的，它告诉我们对心脏功能。我们的半自动化光学检测信号分析方法是一种可靠的方法，推导一个额外的重要参数，从高速跳动的心电影准确的信息，所以做每一个记录的心跳。
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Acknowledgments
KO和AC支持赠款和美国心脏协会的奖学金。 SIB和RB是支持由美国国立卫生研究院的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
