Summary
Vi har utvecklat en semi-automatisk optisk metod Heartbeat Analysis (Soha) för analys av snabba optiska inspelningar från
Abstract
Vi har utvecklat en metod för att analysera höghastighets optiska inspelningar från
Protocol
Klicka här för att se en översikt av semi automatiserade hjärtslag analys (Soha) förfarande.
Semi-automatisk optisk hjärtslag analys
1. Förbehandla -
Detta steg ger information om diastoliskt och systoliskt hjärta diametrar.
Heart kanter är identifierade och märkta under maximal diastole och systole. Optisk inspelningar kan avancerade vid låga hastigheter och även en ruta i taget så exakt identifiering av bilder där maximal kontraktion och avslappning av hjärtat förekommer. Ett par av märken identifiera diastoliska kanter och ett par identifiera systoliskt kanterna görs. Marks kan också göras i två exemplar på olika horisontella platser längs hjärtat.
Hjärtat diameter erhålls i detta steg också för att beräkna ytterligare en mätning som ger en uppskattning av kontraktilitet i hjärtat. Denna åtgärd är den procent fraktionerad förkorta (% FS) och det innebär i vilken utsträckning hjärtat kanterna rör sig mot varandra under en kontraktion. Den formel som används för att beräkna% FS är:
(((Diastoliskt diameter - Systoliskt diameter) / diastoliskt diameter) x 100)
Obs - De punkter som identifierats i denna uppsättning används endast för diameter och fraktionerad mätningar förkorta och används inte för rörelsedetektering.
Exempel: (. Cammarato, et al 2008) I Drosophila, punktmutationer i myosin heavy chain läsgaffel domän, en region känd modulera motorns enzymaktivitet, resultera i hjärtan som är dilaterade eller begränsade beroende på om man undertrycker eller förbättra myosin är ATPas aktivitet . Dessa typer av mätningar kan inte göras i intakta flyger eftersom det oftast inte möjligt att identifiera hjärtat kanter längs hela i hjärtat röret genom nagelband och fett, (jämför Wildtype, D45 och Mhc5 M-lägen i "M-mode Figur "nedan) som normalt omger hjärtat. Mätningar görs när visualisera hjärtat i intakt flugor och andra vanliga metoder som oftast begränsade till de mest främre delen av hjärtat, den koniska kammaren regionen. Det är inte heller möjligt att erhålla denna dynamiska mätningar i fasta vävnaden.
2. Rörelsedetektering-
Detta steg görs automatiskt av programmet och använder två olika algoritmer för att analysera rörelsen i varje film. Kort sagt, den första algoritmen använder "Genomsnittligt Frame Darkness" algoritm en ruta för ruta strategi. Denna algoritm genomsnitt mörkret intensiteten för en hel film ram, normaliserar värdet till ett intervall mellan 0 och 1, och kurvorna de normaliserade genomsnitt för varje bildruta i filmen över tiden. Den andra metoden, den "pixel för pixel" algoritm analyserar förändringar i mörkret för alla de enskilda pixlarna från en ram till nästa. Pixlar som uppvisar intensitet ändras över ett förinställt tröskelvärde summeras för varje bildruta och ritas för varje bildruta i filmen över tiden.
3. Kontrollera intervall-
Utgången från de två algoritmer för rörelsedetektering visas i denna modul med "genomsnittlig Darkness" output visas i ett fönster ovanför "Pixel för pixel" output-fönstret. För att vara säker på att upptäcka mellanrum håller med rörelse i den faktiska filmen visar vi en kant-spår eller M-läge göras från de ramar som analyseras direkt under fönstren algoritmen utgång. M-läget görs av digitalt skära skivor en pixel bred genom hjärtat från varje bildruta i filmen och anpassa dem horisontellt för att ge en ögonblicksbild av rörelser hjärtat kanten över tiden. I "Pixel för pixel" fönster de identifierade diastoliska intervall markeras med en horisontell grön linje med det antal bildrutor som bidrar till att intervall direkt ovanför. Systoliskt intervaller identifieras som intervallet mellan två på varandra diastoler. Början på en systole anges i M-läge med en vertikal blå linje och slutet indikeras med en vertikal röd linje. Med den här skärmen är det relativt enkelt att se om algoritmen utgång överens med de faktiska hjärtat rörelser.
Även rörelsedetektering utförs automatiskt utgången måste kontrolleras för noggrannhet. Det finns flera orsaker till detta, en är att det ofta finns en underliggande, långsamma vågor variationer i ljus nivåer inte är relaterade till hjärtat rörelsen. Detta kan vanligen elimineras med hjälp av ett inbyggt högpassfilter. En andra anledning har att göra med känsligheten på "Pixel för pixel"-metoden. Utgången från denna algoritm är vanligtvis två rörelser spår, en för kontraktion rörelsen och en för avkoppling rörelsen. I äldre flugor och i vissa mutanter hur lång tid mellan dessa två rörelser blir relativt långa och programmet försöker att tolka de två rörelserna som två separata beats. Detta kan korrigeras genom att be programmet att jämföra utdata från pixel för pixel algoritm med de genomsnittliga Frame Darkness algoritm, genom att klicka på "Använd mörkret" rutan.
Exempel (se video): Om 5 till 7 veckor gamla flugor det systoliska intervall är oftast mycket längre än hos yngre flugor. Dessa långa intervall initialt identifieras som två separata värkarna åtskilda av en kort diastole. Detta kan korrigeras genom att välja "Använd mörkret" kryssrutan. I detta fall kommer programmet att jämföra diastoliska intervallet identifieras av pixel för pixel algoritm med genomsnittet Frame Darkness utgång. Om den genomsnittliga Frame Darkness utgång har ett positivt värde, då alla diastoliskt intervall som anges i pixel för pixel algoritm kommer att ignoreras och intervallen blir korrekt angiven. Hela filmen kan skannas i 10 andra segment och accepterade (klicka på "Data OK") eller förkastas (klicka på "Ignorera data"). Hi och Lo Lågpassfilter känslighet kan justeras manuellt för att mer exakt definiera kontraktion mellanrum när de anställer mörkret algoritm.
4. Utgång Statistik-
När utdata för en viss film har accepterats kommer programmet att använda den informationen för att automatiskt beräkna ett antal parametrar. Dessa inkluderar diastoliskt och systoliskt intervall, hjärta period och hjärtfrekvens, riktning och hastighet av nedgången vågen, diametrar hjärta och% FS. Dessutom har programmet flera metoder för att kvantifiera arrhythmicity reflekterande icke-enhetlig sammandragning och cykler avslappning (se Fink et al, 2009). Statistiska resultatet ges för varje film individuellt och för hela datamängden i form av en kommaseparerad värde (. Csv) fil som kan öppnas i kalkylprogram som Microsoft Excel.
Tabell 1 -
Ett exempel på utdata som genereras av halvautomatisk Optisk Heart analysprogram.
5. Uppdatera Histogram-
Denna del av programmet visar alla data på hjärtat intervall under en datamängd i histogram-format. Eftersom hjärtfrekvens varierar vi normalisera histogrammet utdata. Eftersom fördelningen av intervall inte är symmetrisk kring ett medelvärde vi använder medianvärdet intervallet värde för våra normalisering.
Exempel (se video): Flugor som är mutant för KCNQ kalium kanalen visar väldigt oregelbunden diastoliskt och systoliskt mellanrum. Typiskt systoliska intervall är mycket längre och mer oregelbundna än i åldersmatchade wildtype flugor. Detta kan tydligt ses genom att visa data i histogrammet format (se även Ocorr et al. 2007).
6. M-mode-
Denna modul genererar M-lägen som kan göras från vilken position som helst utefter hjärtat i filmen ramen. Längden på M-läge kan också anges. M-lägen är användbara för att visa kvalitativt vad hjärtat gör i en film.
Exempel (se video): Film på en 3 dagar gammal zebrafisk larver hjärta som visar det främre kammare som används för att generera ett M-läge. Den vertikala skiva av pixlar som kommer att vara elektroniskt utskurna från varje filmruta indikeras av en röd linje.
M-mode Figur: Exempel på M-lägena Drosophila och zebrafisk. En av myosin mutationer som diskuteras i förbehandla steg resulterar i en molekylär motor med snabbare enzymkinetik resulterar i hjärtat restriktion och ibland ett ledningshinder. Båda parametrarna kan visas kvalitativt med hjälp av M-lägen. 
M-lägena görs i samma del av hjärtat i både wildtype och muterade flugor visar tydligt den begränsade fenotyp i MHC 5 mutanten och de vidgade diameter och arytmier cykler kontraktion av D45 mutant (som uttrycker myosin med deprimerade enzymkinetik) (modifierad från Cammarato et. al, 2008).
M-mode tillverkad av en Zebrafish larv hjärta som visar det främre kammare (samma hjärta film som visas i demonstrationen, Fink et.al. 2009).
7. Red Dot Film-
Denna modul skapar automatiskt en långsammare (1:4), 20 andra versionen av ett analyserat film som visar alla pixlar som identifieras som förändras i rött. Denna funktion används främst för att illustrera.
Film 1 - En "red dot film" som visar pixlar som identifieras som förändringar mörker intensitet av programmet algoritmer i rött. Filmen hastighet bromsas från den ursprungliga med en faktor 4.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Klicka här för att ladda Film 1.
8. Ytterligare program-
Vi har börjat att tillämpa detta analytiska system till hög hastighet filmer av andra modeller med små hjärtan som ofta är svåra att analysera med traditionella metoder. Vi har framgångsrikt tillämpat denna analys till både zebrafisk larver hjärtan och embryonala hjärtan mus (Fink et al, 2009).
Film 2 - Mus hjärta film plus figur med check intervall med datautgång.
Klicka här för att ladda Movie 2. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila modellen har visat sig vara ett kraftfullt genetiska verktyg som har använts för att ta itu med en rad olika vetenskapliga frågor sträcker sig från embryologiska utveckling till inlärning och minne. Nyligen denna mångsidiga modell organism har använts för att undersöka genetik av hjärtfunktionen. Ett antal försök att kvantifiera hjärtat fysiologi hos vuxna Drosophila har förlitat sig på observationer gjorda i intakt flyger genom buken nagelbanden. De flesta av dessa metoder är beroende av visuell observation eller inspelningar av förändringar i ljusintensitet som överförs via buken att kvantifiera en enda parameter, hjärtfrekvens. Även om detta är en användbar parameter är begränsad i vad den berättar för oss om hjärtfunktionen. Vår halvautomatiska Optisk Heartbeat Analysmetod är en robust metod för att härleda exakt information om ett antal ytterligare viktiga parametrar från hög hastighet filmer av slående hjärtan och göra det för varje hjärtslag i en post.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KO och AC stöds av ett bidrag och ett stipendium från American Heart Association. SIB och RB stöds av anslag från NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
