Summary
Hebben we een semi-automatische Optical Heartbeat Analysis-methode (Soha) voor het analyseren van snelle optische opnamen van
Abstract
We hebben een methode ontwikkeld voor het analyseren van snelle optische opnamen van
Protocol
Klik hier voor een overzicht van de semi-automatische hartslag analyse (Soha) procedure te bekijken.
Semi-automatische optische hartslag analyse
1. Preprocess -
Deze stap geeft informatie over de diastolische en systolische hart diameters.
Heart randen zijn geïdentificeerd en gemarkeerd tijdens maximale diastole en systole. Optische opnamen kunnen worden gevorderd bij lage snelheden en zelfs een frame tegelijk mogelijk maakt exacte identificatie van de frames waar de maximale samentrekking en ontspanning van het hart optreden. Een paar van merktekens die de diastolische randen en een paar identificeren van de systolische randen zijn gemaakt. Merken kunnen ook gemaakt worden in tweevoud op verschillende horizontale locaties langs het hart.
Het hart diameters verkregen in deze stap worden ook gebruikt om een extra meting die een schatting van de contractiliteit van het hart zorgt berekenen. Deze maatregel is het percentage fractionele verkorting (% FS) en het vertegenwoordigt de mate waarin het hart randen naar elkaar toe bewegen tijdens een contractie. De formule wordt gebruikt om% FS te berekenen is:
(((Diastolische diameter - systolische diameter) / diastolische diameter) x 100)
Opmerking - De punten die in deze set zijn alleen gebruikt voor diameter en de fractionele verkorting metingen en worden niet gebruikt voor bewegingsdetectie.
Voorbeeld: (. Cammarato, et al. 2008) In Drosophila, puntmutaties in transducer myosine zware keten het domein, bekend een streek voor het moduleren van de motor enzymatische activiteit, resulteren in harten die zijn verwijde of beperkt, afhankelijk van of ze te onderdrukken of versterken myosine's ATPase activiteit . Deze soorten metingen kunnen niet worden gedaan in intact vliegt omdat het meestal niet mogelijk om het hart randen te identificeren over de gehele lengte van het hart buis door de cuticula en het vet, (vergelijk Wildtype, D45 en Mhc5 M-modes in de "M-mode figuur "hieronder), die normaliter rond het hart. Metingen bij het visualiseren van het hart in intacte vliegt met andere veel gebruikte methoden zijn meestal beperkt tot de meest voorste deel van het hart, de kegelvormige kamer regio. Het is ook niet mogelijk om deze dynamische meting in vaste weefsel.
2. Bewegingsdetectie-
Deze stap gebeurt automatisch door het programma en maakt gebruik van twee verschillende algoritmen om bewegingen te analyseren in elke film. Kortom, de eerste algoritme, de "gemiddelde frame Darkness" algoritme maakt gebruik van een frame voor frame aanpak. Dit algoritme gemiddelde intensiteit van de duisternis voor een hele film frame, normaliseert de waarde voor een interval tussen 0 en 1, en plots de genormaliseerde gemiddelde voor elk frame in de film in de tijd. De tweede benadering, de "pixel voor pixel"-algoritme, analyseert de verandering in de duisternis van alle individuele pixels van het ene frame naar de volgende. Pixels die intensiteit verandert boven een vooraf ingestelde drempel vertonen worden opgeteld voor elk frame en uitgezet voor elk frame in de film in de tijd.
3. Check-intervallen
De output van de twee beweging detectie algoritmen wordt in deze module met de "gemiddelde Darkness" output weergegeven in een venster boven de "pixel voor pixel" output venster. Om zeker te zijn dat de detectie-intervallen eens zijn met beweging in de eigenlijke film hebben we weer een edge-trace of M-mode gemaakt van de frames wordt geanalyseerd direct onder het algoritme uitgang ramen. De M-mode wordt gemaakt door digitaal te snijden plakken een pixel breed door het hart van elk frame in de film en uitlijnen van hen horizontaal naar een momentopname van het hart rand bewegingen over tijd te geven. In de "pixel per pixel" venster de geïdentificeerde diastolische intervallen worden aangegeven met een horizontale groene lijn met het aantal frames bij te dragen aan dat interval direct boven. Systolische intervallen worden geïdentificeerd als het interval tussen twee opeenvolgende diastoles. Het begin van een systole wordt aangegeven in de M-modus door een verticale blauwe lijn en het einde wordt aangegeven door een verticale rode lijn. Met dit scherm is het relatief eenvoudig om te zien of het algoritme-uitgang is het eens met de werkelijke hart bewegingen.
Hoewel de bewegingsdetectie wordt automatisch uitgevoerd de output moet worden gecontroleerd op juistheid. Er zijn verschillende redenen voor, een is dat er vaak een onderliggende, trage golf schommeling in het lichtniveau niet gerelateerd aan het hart beweging. Dit kan doorgaans worden geëlimineerd door het gebruik van een ingebouwde high pass filter. Een tweede reden heeft te maken met de gevoeligheid van de 'Pixel voor pixel "-benadering. De uitvoer van dit algoritme is meestal twee beweging sporen, een voor de contractie beweging en een voor de ontspanning beweging. In oudere vliegen en in sommige mutanten de lengte van de tijd tussen deze twee bewegingen wordt relatief lang en het programma probeert de twee bewegingen te interpreteren als twee afzonderlijke beats. Dit kan worden verholpen door te vragen het programma om de output van de Pixel vergelijken Pixel algoritme met die van de gemiddelde frame Darkness-algoritme, door te klikken op de "Use duisternis" box.
Voorbeeld (zie video): in 5 tot 7 week oud vliegt de systolische intervallen zijn meestal veel langer dan bij jonge vliegen. Deze lange intervallen worden in eerste instantie herkend als twee afzonderlijke contracties van elkaar gescheiden door een korte diastole. Dit kan worden gecorrigeerd door het selecteren van de "Use duisternis" in. In dit geval zal het programma vergelijkt de diastolische interval vastgesteld door de pixel per pixel algoritme met de gemiddelde frame Duisternis output. Als de gemiddelde Frame Duisternis uitgang heeft een positieve waarde, dan is elke diastolisch interval vastgesteld in het pixel voor pixel-algoritme worden genegeerd en de intervallen correct worden gespecificeerd. De hele film kunnen worden gescand in 10 seconden segmenten en geaccepteerd (klik op "Data OK") of verworpen (klik op "Discard gegevens"). De Hi en Lo-pass filter gevoeligheden kan handmatig worden aangepast om nauwkeuriger te helpen bij het bepalen samentrekking intervallen bij gebruik van de Duisternis algoritme.
4. Uitgang Statistiek-
Zodra de uitgang voor een bepaalde film is aanvaard, het programma zal deze informatie gebruiken om automatisch te berekenen van een aantal parameters. Deze omvatten diastolische en systolische interval-, hart-periode en de hartslag, de richting en snelheid van de contractie golf, hart diameters, en% FS. Daarnaast heeft het programma meerdere methoden voor het kwantificeren van arrhythmicity weerspiegelt niet-uniforme samentrekking en ontspanning cycli (zie Fink et al., 2009). Statistische output is voorzien voor elke film afzonderlijk en voor de gehele dataset in de vorm van een door komma's gescheiden waarde (. Csv) bestand dat kan worden geopend in spreadsheet programma's zoals Microsoft Excel.
Tabel 1 -
Een voorbeeld van de output gegenereerd door de Semi-automatische Optical Heart Analysis programma.
5. Update-histogrammen-
Dit gedeelte van het programma toont alle gegevens op hart-intervallen voor een dataset in histogram-formaat. Aangezien de hartslag variabel zijn we normaliseren het histogram output data. Echter, omdat de verdeling van de intervallen is niet symmetrisch rond een gemiddelde gebruiken we de mediaan interval waarde voor onze normalisatie.
Voorbeeld (zie video): Vliegen die mutant zijn voor de KCNQ kaliumkanaal tonen zeer onregelmatige diastolische en systolische intervallen. Typisch de systolische intervallen zijn veel langer en meer onregelmatige dan in de leeftijd gematchte wildtype vliegen. Dit is duidelijk te zien door het tonen van de gegevens in histogram-formaat (zie ook Ocorr et al. 2007)..
6. M-mode-
Deze module genereert M-modes die gemaakt kunnen worden vanuit elke positie langs het hart in de film frame. De lengte van de M-modus kan ook worden gespecificeerd. M-modes zijn nuttig om kwalitatief laten zien wat het hart doet in een film.
Voorbeeld (zie video): Filmpje van een drie dagen oude zebravis larvale hart met de voorste hartkamer die wordt gebruikt om een M-mode te genereren. De verticale doorsnede van de pixels die elektronisch zullen worden uitgesneden uit elke film frame wordt aangegeven door een rode lijn.
M-mode Figuur: Voorbeelden van M-modes van Drosophila en zebravis. Een van de myosine mutaties besproken in de Preprocessen stap resulteert in een moleculaire motor met snellere enzymkinetiek wat resulteert in het hart beperking en af en toe een geleiding blok. Beide parameters kunnen worden aangetoond met behulp van kwalitatief M-modes. 
M-modes die in hetzelfde deel van het hart, zowel in wildtype en mutante vliegen duidelijk de beperkte fenotype in de MHC 5 mutant en de verwijde diameters en aritmische samentrekking cycli van de D45 mutant (die myosine uitdrukt met depressieve enzymkinetiek) (gewijzigd van Cammarato et. al., 2008).
M-mode gemaakt van een zebravis larvale hart met de voorste ventrikel (hetzelfde hart film, zoals aangegeven in de demonstratie, Fink et.al. 2009).
7. Red Dot Movie-
Deze module produceert automatisch een vertraagde (1:04), 20 tweede versie van een film waarin alle geanalyseerde de pixels die worden geïdentificeerd als het wijzigen van in het rood. Deze functie wordt vooral gebruikt ter illustratie.
Film 1 - Een "red dot film" waarin de pixels die worden geïdentificeerd als zijnde de duisternis intensiteit verandert met het programma algoritmen in het rood. De film snelheid is vertraagd van het origineel met een factor 4.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Klik hier om een film te downloaden.
8. Extra toepassingen-
We zijn begonnen met deze analytische systeem toe te passen op hoge snelheid films van andere modellen met kleine hartjes die vaak moeilijk te analyseren met behulp van traditionele methodologie. We hebben met succes toegepast deze analyse voor zowel zebravis larvale harten en embryonale harten muis (Fink et al., 2009).
Movie 2 - Muis hart movie plus figuur met check intervallen met data-uitgang.
Klik hier om Movie 2 te downloaden. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het Drosophila model heeft bewezen een krachtig instrument dat genetische is gebruikt om een verscheidenheid aan wetenschappelijke vragen, variërend van embryonale ontwikkeling tot leren en geheugen adres. Onlangs is dit veelzijdige model organisme is gebruikt om de genetica van de hartfunctie te onderzoeken. Een aantal pogingen om het hart fysiologie kwantificeren bij volwassen Drosophila hebben vertrouwd op de waarnemingen in intacte vliegt door de buik cuticula. De meeste van deze benaderingen zijn afhankelijk van visuele waarneming of opnames van de veranderingen in de lichtintensiteit die via de buik van een enkele parameter, de hartslag te kwantificeren. Hoewel dit een nuttige parameter is beperkt in wat het vertelt ons over de werking van het hart. Onze Semi-automatische Optical Heartbeat Analysis-methode is een stevige aanpak voor het afleiden van accurate informatie over een aantal extra belangrijke parameters van de hoge snelheid films van kloppende harten en om dat te doen voor iedere hartslag in een record.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KO en AC worden ondersteund door een subsidie en een fellowship van de American Heart Association. SIB en RB worden ondersteund door subsidies van NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
