Summary
Wir haben eine Semi-automatische optische Heartbeat Analysemethode (SOHA) für die Analyse von optischen Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen aus den entwickelten
Abstract
Wir haben ein Verfahren zur Analyse optischen Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen aus den entwickelten
Protocol
Semi-automatische optische Herzschlag Analyse
1. Vorverarbeitung -
Dieser Schritt gibt Auskunft über den diastolischen und systolischen Herz Durchmesser.
Herz Kanten werden erkannt und während der maximalen Diastole und Systole markiert. Optische Aufnahmen können bei niedrigen Geschwindigkeiten und sogar ein Bild in einer Zeit, die eine genaue Identifizierung der Rahmen, bei denen maximale Kontraktion und Entspannung des Herzens auftreten vorangetrieben werden. Ein Paar Marken, mit denen der diastolische Kanten und ein Paar Identifizierung des systolischen Kanten sind. Marks können auch in zweifacher Ausfertigung bei verschiedenen horizontalen Positionen entlang des Herzens gemacht werden.
Das Herz Durchmesser in diesem Schritt erhalten werden auch verwendet, um eine zusätzliche Messung, die eine Abschätzung der Kontraktilität des Herzens bietet berechnen. Diese Maßnahme ist die prozentuale fraktionelle Verkürzung (% FS) und stellt das Ausmaß, in dem das Herz Kanten aufeinander zu bewegen während einer Kontraktion. Die Formel zur Berechnung% FS ist:
(((Diastolischer Durchmesser - Systolischer Durchmesser) / diastolischer Durchmesser) x 100)
Hinweis - Die Punkte in diesem Satz identifiziert sind nur für den Durchmesser und die fraktionelle Verkürzung Messungen verwendet und nicht für Bewegungserkennung eingesetzt.
Beispiel: (. Cammarato, et al 2008) In Drosophila, Punktmutationen in Myosin schwere Kette der Geber-Domäne, eine Region bekannt zu modulieren des Motors enzymatische Aktivität, Ergebnis in Herzen, die erweitert oder sind abhängig davon, ob sie zu unterdrücken oder zu verbessern Myosin ist ATPase-Aktivität beschränkt . Diese Arten von Messungen können nicht in intakten Fliegen gemacht werden, wie es in der Regel nicht möglich ist, zu Herzen Kanten entlang der gesamten Länge des Herzens Rohr durch die Kutikula und das Fett zu identifizieren, (vgl. Wildtyp, D45 und Mhc5 M-Modi in "M-Modus Abbildung "weiter unten), die normalerweise umschließen das Herz. Die Messungen erfolgten bei der Visualisierung des Herzens in intakten Fliegen mit anderen häufig verwendeten Methoden sind in der Regel zu den vorderen Teil des Herzens, die konische Kammer Region beschränkt. Es ist auch nicht möglich, diese dynamische Messung in fixiertem Gewebe zu erhalten.
2. Movement Detection-
Dieser Schritt wird automatisch vom Programm erledigt und verwendet zwei verschiedene Algorithmen, um Bewegung in jeden Film zu analysieren. Kurz gesagt, der erste Algorithmus, verwendet die "Average Rahmen Darkness"-Algorithmus ein Frame für Frame-Ansatz. Dieser Algorithmus Mittelwerte der Dunkelheit die Intensität für einen ganzen Film Frame, normalisiert den Wert auf ein Intervall zwischen 0 und 1, und die Kurven der normierten Durchschnitt für jeden Frame in dem Film über die Zeit. Der zweite Ansatz, die "Pixel für Pixel"-Algorithmus analysiert die Veränderung in der Dunkelheit der die einzelnen Pixel von einem Bild zum nächsten. Pixel, die Intensität Veränderungen über einen voreingestellten Schwellenwert aufweisen, sind für jeden Frame zusammengefasst und dargestellt für jeden Frame in dem Film über die Zeit.
3. Prüfintervalle-
Die Ausgabe der beiden Bewegungsmelder Algorithmen ist in diesem Modul mit der "Average Darkness"-Ausgabe in einem Fenster über dem "Pixel für Pixel" Ausgabefenster angezeigt angezeigt. Um sicher zu sein, dass der Nachweis Abständen mit Bewegung stimmen in der eigentlichen Film zeigen wir eine Kante-trace-oder M-Modus aus dem Rahmen, die direkt unterhalb des Algorithmus Ausgabefenster analysiert gemacht. Die M-Modus wird durch digital schneiden Scheiben ein Pixel breit durch das Herz von jedem Bild im Film und passen sie horizontal, um einen Schnappschuss des Herzens Rand Bewegungen im Laufe der Zeit gegeben haben. In der "Pixel für Pixel"-Fenster die ermittelten diastolischen Intervalle sind durch eine horizontale grüne Linie mit der Anzahl der Frames einen Beitrag zu diesem Intervall direkt oben angegeben. Systolischer Intervalle werden als Intervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Diastolen identifiziert. Der Beginn einer Systole in den M-Modus durch eine senkrechte blaue Linie angezeigt und das Ende ist durch eine vertikale rote Linie dargestellt. Mit dieser Anzeige ist es relativ einfach zu sehen, ob der Algorithmus Ausgabe stimmt mit der tatsächlichen Herzen Bewegungen.
Obwohl Bewegungserkennung automatisch durchgeführt wird, muss die Ausgabe auf ihre Richtigkeit überprüft werden. Es gibt mehrere mögliche Gründe dafür ist, dass es oft eine zugrundeliegende, Slow-Wave-Fluktuation in Lichtverhältnisse nicht auf die Herzbewegung verwandt. Dies kann in der Regel durch Verwendung eines eingebauten Hochpassfilter eliminiert werden. Eine zweite Grund hat mit der Empfindlichkeit des "Pixel für Pixel"-Ansatz zu tun. Die Ausgabe dieses Algorithmus ist in der Regel zwei Bewegung Spuren, eine für die Kontraktion und eine für die Entspannung Bewegung. In älteren fliegt und in einigen Mutanten die Länge der Zeit zwischen diesen beiden Bewegungen wird relativ lange und das Programm versucht, die beiden Bewegungen als zwei separate Schläge zu interpretieren. Dies kann, indem er das Programm auf den Ausgang der Pixel für Pixel-Algorithmus zu vergleichen mit dem der durchschnittliche Frame-Dunkel-Algorithmus korrigiert werden, indem Sie auf den "Use Dunkelheit" ein.
Beispiel (siehe Video): In 5 bis 7 Wochen alte fliegt der systolischen Intervalle sind in der Regel viel länger als bei jungen Fliegen. Diese lange Intervalle werden zunächst als zwei getrennte Kontraktionen durch einen kurzen Diastole getrennt nachgewiesen werden. Dies kann durch die Auswahl der "Use Finsternis" Kontrollkästchen korrigiert werden. In diesem Fall wird das Programm vergleichen den diastolischen Intervall durch die Pixel für Pixel-Algorithmus identifiziert mit dem Durchschnitt Rahmen Dunkelheit Ausgang. Wenn die durchschnittliche Frame-Dunkel-Ausgang hat einen positiven Wert, dann ist jede diastolischen Intervall in der Pixel für Pixel-Algorithmus identifiziert werden ignoriert und die Intervalle korrekt angegeben werden. Der gesamte Film kann in 10 Sekunden Segmente gescannt werden und akzeptiert (klicken Sie auf "Data OK") oder abgelehnt (klicken Sie auf "Discard Daten"). Die Hallo und Lo Pass Filter Empfindlichkeiten kann manuell eingestellt werden, um genauer zu definieren helfen Kontraktion Abständen beim Einsatz der Finsternis Algorithmus.
4. Output Statistics-
Sobald die Ausgabe für einen bestimmten Film akzeptiert wurde das Programm nutzen, dass Informationen zur automatischen Berechnung einer Reihe von Parametern. Dazu gehören diastolischen und systolischen Intervall-, Herz-Zeit und Herzfrequenz, Richtung und Geschwindigkeit der Kontraktion Welle, Herz-Durchmesser und% FS. Darüber hinaus hat das Programm mehrere Methoden zur Quantifizierung arrhythmicity reflektieren ungleichmäßige Kontraktion und Entspannung Zyklen (siehe Fink et al, 2009). Statistische Ausgang ist für jeden Film einzeln und für die gesamten Daten in Form einer (Comma Separated Value. Csv-Datei), die in Tabellenkalkulationsprogrammen wie Microsoft Excel geöffnet werden kann, setzen zur Verfügung gestellt.
Tabelle 1 -
Ein Beispiel für die Ausgabe durch die Semi-automatische optische Herz Analyse-Programm generiert.
5. Update-Histogramme-
Dieser Teil des Programms werden alle Daten auf Herz Abständen für eine Datenmenge in Histogramm-Format. Da Herzfrequenz variabel sind wir zu normalisieren das Histogramm Ausgangsdaten. Da jedoch die Verteilung der Intervalle ist nicht symmetrisch um einen Mittelwert verwenden wir die mittlere Intervall Wert für unsere Normalisierung.
Beispiel (siehe Video): Flies, dass mutierte sind für die KCNQ Kaliumkanal zeigen extrem unregelmäßig diastolischen und systolischen Intervalle. Typischerweise werden die systolischen Intervalle sind viel länger und unregelmäßiger als bei gleichaltrigen Wildtyp-Fliegen. Dies ist deutlich durch die Anzeige der Daten in Histogramm-Format betrachtet werden (siehe auch Ocorr et al. 2007).
6. M-mode-
Dieses Modul generiert M-Modi, die aus jeder Position entlang des Herzens in der Movie-Rahmen gemacht werden. Die Länge der M-Modus kann auch angegeben werden. M-Modi sind nützlich, um qualitativ zu zeigen, was das Herz ist in einem Film zu tun.
Beispiel (siehe Video): Movie eines 3 Tage alten Zebrafisch-Larven Herz zeigt die vordere Kammer, die verwendet werden, um einen M-Modus zu erzeugen. Die vertikale Scheibe der Pixel, die elektronisch von jedem Film Rahmen herausgeschnitten werden wird durch eine rote Linie angezeigt.
M-Mode-Bild: Beispiele für M-Modi von Drosophila und Zebrafisch. Einer der Myosin-Mutationen in der Vorverarbeitung Schritt führt in einen molekularen Motor mit schneller Enzymkinetik was zu Herzen Einschränkung und gelegentlich ein Leitungsblock diskutiert. Beide Parameter können angezeigt qualitativ mit M-Modi werden. 
M-Modi in den gleichen Teil des Herzens in beiden Wildtyp und Mutante Fliegen machen deutlich, die eingeschränkte Phänotyp in den MHC-5-Mutante und dem erweiterten Durchmesser und Arrhythmie Kontraktion Zyklen der D45-Mutante (die Myosin drückt mit gedrückter Enzymkinetik) (modifiziert von Cammarato et. al, 2008).
M-Modus von einem Zebrafisch Larven Herz zeigt die vordere Kammer (gleiche Herz Film wie in der Demonstration, Fink et.al. 2009 gezeigt) hergestellt.
7. Red Dot Movie-
Dieses Modul erzeugt automatisch eine verlangsamte (1:4), 20 Sekunden Version eines analysierten Film zeigt alle Pixel, die als Veränderung in rot gekennzeichnet sind. Diese Funktion ist in erster Linie zur Illustration verwendet.
Movie 1 - A "red dot Film" zeigt die Pixel, die als mit Dunkelheit Intensität Veränderungen durch das Programm-Algorithmen in rot gekennzeichnet sind. Der Film Geschwindigkeit ist von der ursprünglichen um einen Faktor von 4 verlangsamt.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Klicken Sie hier, um Movie 1 herunterladen.
8. Zusätzliche Anwendungen-
Wir haben begonnen, diese analytische System zu hoher Geschwindigkeit Filme von anderen gelten für Fahrzeuge mit kleinen Herzen, die oft schwer zu analysieren mit traditionellen Methoden. Wir haben erfolgreich diese Analyse sowohl Zebrafisch Larven Herzen und embryonalen Mäuseherzen (Fink et al, 2009) angewendet.
Movie 2 - Maus Herzen Movie Plus Figur mit Prüfintervalle mit Datenausgang.
Klicken Sie hier, um Movie 2 herunterladen. 
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Discussion
Die Drosophila-Modell hat sich als ein leistungsfähiges Tool, das genetische verwendet wurde, um eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragestellungen reichen von embryonalen Entwicklung, Lernen und Gedächtnis-Adresse sein. Kürzlich dieses vielseitige Modell-Organismus wurde verwendet, um die Genetik von Herz-Funktion zu untersuchen. Eine Reihe von Versuchen, Herz Physiologie bei erwachsenen Drosophila zu quantifizieren sind auf Beobachtungen in intakten fliegt durch die Bauchdecke Nagelhaut, gelten. Die meisten dieser Ansätze hängen visuelle Beobachtung oder Aufnahmen von Veränderungen in der Lichtintensität durch die Bauchdecke übertragen, um einen einzigen Parameter, die Herzfrequenz zu quantifizieren. Obwohl dies ein nützlicher Parameter ist es, was es erzählt uns über die Herzfunktion eingeschränkt. Unser Semi-automatische optische Heartbeat Analyse-Methode ist ein robustes Konzept für die Ableitung von genauen Informationen über eine Reihe von weiteren wichtigen Parameter von High-Speed-Filme von schlagenden Herzen und zwar für jeden Herzschlag in einem Datensatz.
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Acknowledgments
KO und AC sind durch ein Stipendium und ein Stipendium der American Heart Association unterstützt. SIB und RB werden durch Zuschüsse aus NIH unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
