Summary
Nós desenvolvemos um método semi-automático de análise Optical Heartbeat (SOHA) para analisar as gravações ópticas de alta velocidade a partir de
Abstract
Nós desenvolvemos um método para analisar gravações ópticas de alta velocidade a partir de
Protocol
Semi-automático de análise batimentos cardíacos óptico
1. Preprocess -
Esta etapa fornece informações sobre os diâmetros cardíaca diastólica e sistólica.
Bordas cardíacas são identificadas e marcadas durante a diástole e sístole máximas. Gravações ópticas podem ser avançados em velocidades lentas e até mesmo um fotograma de cada vez que permite a identificação precisa dos quadros onde contração máxima e relaxamento do coração ocorrer. Um par de marcas de identificação das bordas diastólica e um par identificar as bordas sistólica são feitas. Marcas também podem ser feitas em duplicado, em diferentes locais horizontal ao longo do coração.
Os diâmetros cardíaca obtida nesta etapa também são usados para calcular uma medida adicional que fornece uma estimativa da contratilidade do coração. Esta medida é a redução fracionária por cento (% FS) e representa a medida em que as bordas do coração se deslocando em direção ao outro durante uma contração. A fórmula utilizada para calcular FS% é:
((Diâmetro (diastólica - diâmetro sistólica) / diâmetro diastólico) x 100)
Nota - Os pontos identificados neste conjunto são utilizados apenas para medições de diâmetro e encurtamento e não são utilizados para a detecção de movimento.
Exemplo: (. Cammarato, et al 2008) Em Drosophila, mutações pontuais no domínio da miosina de cadeia pesada de transdutor, uma região conhecida para modular a atividade enzimática do motor, resultam em corações que estão dilatados ou restrito, dependendo se eles suprimir ou aumentar a atividade da miosina de ATPase . Estes tipos de medições não pode ser feita em moscas intacta, uma vez que geralmente não é possível identificar as bordas do coração em todo o comprimento do tubo cardíaco através da cutícula e da gordura, (compare tipo selvagem, D45 e Mhc5 M-modos em "modo-M Figura "abaixo) que normalmente cercam o coração. Medições feitas ao visualizar o coração em moscas intacta com outros métodos comumente empregados são geralmente restrito à porção mais anterior do coração, a região câmara cônica. Também não é possível obter esta medida dinâmica no tecido fixo.
2. Detecção de movimento
Este passo é feito automaticamente pelo programa e utiliza dois algoritmos diferentes para analisar o movimento em cada filme. Resumidamente, o primeiro algoritmo, o "Quadro Média Darkness" algoritmo usa um quadro de abordagem frame. Este algoritmo de médias a intensidade escuridão para um quadro do filme inteiro, normaliza o valor para um intervalo entre 0 e 1, e parcelas a média normalizada para cada frame do filme ao longo do tempo. A segunda abordagem, o "pixel a pixel" algoritmo, analisa a mudança na escuridão de todos os pixels individuais de um quadro para o próximo. Pixels que apresentam alterações de intensidade acima de um limite pré-são somados para cada quadro e plotados para cada frame do filme ao longo do tempo.
3. Verifique Intervalos-
A saída dos dois algoritmos de detecção de movimento é exibido neste módulo com o "Average Darkness" saída exibida em uma janela acima do "Pixel por pixel" janela de saída. , A fim de ter certeza de que os intervalos de detecção de movimento em concordar com o filme real exibimos uma vantagem traço ou M-mode feito a partir dos quadros de ser analisados diretamente abaixo das janelas de saída do algoritmo. O modo-M é feita por corte fatias digitalmente um pixel de largura através do coração de cada quadro no filme e alinhando-as na horizontal para fornecer um instantâneo dos movimentos do coração borda ao longo do tempo. No "Pixel por pixel" janela os intervalos identificados diastólica são indicados por uma linha horizontal verde com o número de quadros que contribuem para esse intervalo imediatamente acima. Intervalos sistólicos são identificados como o intervalo entre duas diástoles sucessivas. O início de uma sístole é indicado no modo-M por uma linha vertical azul e no final é indicado por uma linha vertical vermelha. Com esta exposição é relativamente fácil de ver se a saída algoritmo concorda com os movimentos do coração real.
Apesar de detecção de movimento é realizado automaticamente a saída deve ser verificado a exatidão. Existem várias razões para isso: uma é que muitas vezes há um subjacente, a flutuação de ondas lentas nos níveis de luz não relacionados com o movimento do coração. Isto normalmente pode ser eliminada por utilização de um construído em filtro passa alta. A segunda razão tem a ver com a sensibilidade do "Pixel por pixel" abordagem. A saída desse algoritmo é normalmente de dois traços movimento, um para o movimento de contração e um para o movimento de relaxamento. Em moscas mais velhas e, em alguns mutantes o período de tempo entre esses dois movimentos torna-se relativamente longo eo programa tenta interpretar os dois movimentos como duas batidas separadas. Isso pode ser corrigido fazendo o programa para comparar a saída da Pixel por Pixel algoritmo com a do algoritmo Média Quadro Darkness, clicando em "Use trevas" caixa.
Exemplo (veja vídeo): Em 5-7 semanas de idade voa a intervalos sistólicos são tipicamente muito mais do que em moscas jovens. Estes longos intervalos são inicialmente detectadas como duas contrações separadas por um curto diástole. Isso pode ser corrigido selecionando a opção "Use trevas" caixa de seleção. Neste caso, o programa irá comparar o intervalo diastólica identificada pela Pixel por Pixel algoritmo com a média de saída de quadros Darkness. Se a saída Trevas Média quadro tem um valor positivo, então qualquer intervalo diastólica identificada na Pixel por Pixel algoritmo será ignorado e os intervalos serão especificados corretamente. O filme inteiro podem ser digitalizados em 10 segmentos segundo e aceite (clique em "OK Dados") ou rejeitada (clique em "Discard Dados"). O Hi Lo e sensibilidades passar filtro pode ser ajustado manualmente para ajudar a definir com mais precisão intervalos contração quando se emprega o algoritmo Darkness.
4. Estatísticas de saída
Uma vez que a saída para um filme dado foi aceite o programa vai usar essa informação para calcular automaticamente uma série de parâmetros. Estes incluem intervalo diastólica e sistólica, período do coração e da freqüência cardíaca, direção e velocidade da onda de contração FS, diâmetros coração, e%. Além disso, o programa tem vários métodos para quantificar arrhythmicity refletindo contração não-uniforme e ciclos de relaxamento (ver Fink et al, 2009). Produção de estatísticas é fornecido para cada filme individualmente e para os dados de todo o conjunto na forma de um valor separado por vírgula (. Csv) que pode ser aberto em programas de planilhas como o Microsoft Excel.
Tabela 1 -
Um exemplo da saída gerada pelo programa de análise semi-automatizada Optical Coração.
5. Atualize-Histogramas
Esta parte do programa apresenta todos os dados em intervalos de coração por um conjunto de dados em formato de histograma. Como as taxas são variáveis coração que normalize os dados de saída do histograma. No entanto, porque a distribuição dos intervalos não é simétrica em torno de um significa que usar o valor do intervalo médio para o nosso normalização.
Exemplo (veja vídeo): Moscas que são mutantes para o canal de potássio KCNQ mostram extremamente irregular intervalos diastólica e sistólica. Tipicamente, a intervalos sistólicos são muito mais longos e mais irregular do que na mesma faixa etária moscas do tipo selvagem. Isso pode ser claramente visto, exibindo os dados no formato de histograma (ver também Ocorr et al. 2007).
6. M-mode-
Este módulo gera M-modos que podem ser feitas a partir de qualquer posição ao longo do coração no quadro do filme. O comprimento do modo-M também pode ser especificado. M-modos são úteis para mostrar qualitativamente o que o coração está fazendo em um filme.
Exemplo (veja vídeo): Filme de um coração zebrafish três dias de idade larval mostrando o ventrículo anterior que é usado para gerar um modo-M. A fatia vertical de pixels que será extirpado por via electrónica a partir de cada quadro do filme é indicado por uma linha vermelha.
M-mode Figura: Exemplos de M-modos de Drosophila e zebrafish. Uma das mutações miosina discutido nos resultados da etapa Preprocess em um motor molecular com cinética mais rápida da enzima, resultando em restrição de coração e, ocasionalmente, um bloco de condução. Ambos os parâmetros podem ser mostrados qualitativa utilizando M-modos. 
M-modos feitas na mesma porção do coração em ambos os tipo selvagem e moscas mutantes mostram claramente o fenótipo restrito no Mhc 5 mutantes e os diâmetros dilatada e os ciclos de contração arrítmicos do mutante D45 (que expressa miosina com cinética enzimática deprimido) (modificada de Cammarato et. al, 2008).
M-mode feita a partir de um coração Zebrafish larval mostrando o ventrículo anterior (filme mesmo coração, como mostrado na demonstração, Fink et.al. 2009).
7. Red Dot-Movie
Este módulo produz automaticamente um retardado (1:4), 20 segunda versão de um filme analisado, mostrando todos os pixels que são identificados como mudança na cor vermelha. Este recurso é usado principalmente para fins de ilustração.
Filme 1 - Um "filme red dot", mostrando os pixels que são identificados como tendo alterações de intensidade escuridão pelos algoritmos de programa em vermelho. A velocidade do filme é lento a partir do original por um fator de 4.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Clique aqui para baixar Filme 1.
8. Aplicações adicionais-
Começamos a aplicar este sistema de análise de filmes de alta velocidade de outros modelos com corações pequenos que muitas vezes são difíceis de analisar utilizando a metodologia tradicional. Nós temos aplicado com sucesso essa análise para ambos os corações zebrafish larval e corações embrionárias de camundongos (Fink et al, 2009).
Filme 2 - filme rato coração mais figura com intervalos de verificação com saída de dados.
Clique aqui para baixar Filme 2. 
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Discussion
O modelo de Drosophila provou ser uma poderosa ferramenta genética que tem sido utilizado para tratar uma variedade de questões científicas que vão desde desenvolvimento embrionário para a aprendizagem e memória. Recentemente, este organismo modelo versátil, tem sido usado para investigar a genética da função cardíaca. Uma série de tentativas para quantificar a fisiologia do coração em adultos Drosophila têm contado com observações feitas em moscas intacta através da cutícula abdominal. A maioria dessas abordagens dependem da observação visual ou gravações de mudanças na intensidade da luz transmitida através do abdômen para quantificar um único parâmetro, a freqüência cardíaca. Embora este seja um parâmetro útil é limitado no que ela nos diz sobre a função cardíaca. Nosso Semi-automatizado método de Análise de Optical Heartbeat é uma abordagem robusta para derivar informações precisas sobre uma série de parâmetros adicionais importantes de filmes de alta velocidade de bater corações, e para fazê-lo por cada batimento cardíaco em um registro.
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Acknowledgments
KO e AC são suportados por uma bolsa e uma bolsa de estudos da Associação Americana do Coração. SIB e RB são suportados por concessões do NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
