Summary
Abbiamo sviluppato un semi-automatico ottica Metodo di analisi Heartbeat (SoHa) per analizzare le registrazioni ottico ad alta velocità da
Abstract
Abbiamo sviluppato un metodo per analizzare le registrazioni ottico ad alta velocità da
Protocol
Semi-automatici di analisi battito cardiaco ottico
1. Pre-elaborazione -
Questa operazione fornisce informazioni sulla diametri cuore diastolica e sistolica.
Bordi cuore sono identificati e contrassegnati massimo durante la diastole e sistole. Registrazioni ottiche possono essere avanzate a velocità lenta e anche un solo fotogramma alla volta permettendo un'identificazione precisa del frame in cui massima contrazione e rilassamento del cuore si verificano. Un paio di marchi che identificano i bordi diastolica e un paio identificare i bordi sistolica sono fatti. Marchi può essere fatta anche in duplice copia a diverse posizioni orizzontali lungo il cuore.
I diametri cuore ottenuto in questa fase vengono anche utilizzati per calcolare una misura aggiuntiva che fornisce una stima della contrattilità del cuore. Questa misura è l'accorciamento frazionale per cento (% FS) e rappresenta la misura in cui i bordi cuore muovono l'uno verso l'altro durante una contrazione. La formula utilizzata per calcolare% FS è:
(((Diastolica diametro - diametro sistolica) / diastolica di diametro) x 100)
Nota - I punti individuati in questa serie sono utilizzati solo per il diametro e le misure di accorciamento frazionale e non sono utilizzati per il rilevamento del movimento.
Esempio: (. Cammarato, et al 2008) in Drosophila, mutazioni puntiformi nel dominio trasduttore catena pesante della miosina, una regione conosciuta per modulare l'attività enzimatica del motore, risultato di cuori che si dilatano o limitato a seconda che sopprimono o migliorare l'attività ATPasica della miosina è . Questi tipi di misurazioni non possono essere realizzati in vola intatto come di solito non è possibile identificare i bordi cuore tutta la lunghezza del tubo cuore attraverso la cuticola e il grasso, (confronta tipo selvatico, D45 e Mhc5 M-modalità in "M-mode Figura "di seguito) che normalmente circondano il cuore. Le misurazioni effettuate quando visualizzare il cuore in mosche intatto con altri metodi comunemente impiegati di solito sono limitati alla parte più anteriore del cuore, la regione camera conica. Non è inoltre possibile ottenere questo tipo di misurazione dinamica nel tessuto fisso.
2. Movement Detection-
Questo passo è fatto automaticamente dal programma e utilizza due diversi algoritmi per analizzare il movimento in ogni film. In breve, il primo algoritmo, la "media Tenebre Frame" algoritmo utilizza un frame approccio telaio. Questo algoritmo media l'intensità buio di un frame intero film, normalizza il valore di un intervallo compreso tra 0 e 1, e le trame della media normalizzata per ogni fotogramma del film nel corso del tempo. Il secondo approccio, il "pixel per pixel" algoritmo, analizza i cambiamenti nel buio di tutti i singoli pixel da un fotogramma all'altro. Pixel che presentano variazioni di intensità di sopra di una soglia prefissata vengono sommati per ogni fotogramma e tracciati per ogni fotogramma del film nel corso del tempo.
3. Intervalli di controllo-
L'uscita dal movimento di due algoritmi di rilevamento è visualizzata in questo modulo con i "media Darkness" di output visualizzato in una finestra al di sopra del "Pixel per pixel" finestra di uscita. Per essere sicuri che gli intervalli di rilevazione d'accordo con il movimento nel film reale che viene visualizzato un bordo-traccia o M-mode fatto da cornici in fase di analisi direttamente sotto le finestre di uscita dell'algoritmo. L'M-mode è composto da digitalmente tagliando fette larghe un pixel attraverso il cuore da ogni fotogramma del film e allineando in orizzontale per fornire un'istantanea dei movimenti filo del cuore nel corso del tempo. Nella "pixel per pixel" finestra gli intervalli individuati diastolica sono indicate da una linea orizzontale verde con il numero di fotogrammi che contribuiscono a tale intervallo direttamente sopra. Intervalli di pressione sistolica sono identificati come l'intervallo tra due successive diastole. L'inizio di una sistole è indicato nel M-mode da una linea verticale blu e alla fine è indicato da una linea verticale rossa. Con questo display è relativamente facile vedere se l'uscita algoritmo è d'accordo con i movimenti cuore vero e proprio.
Anche se il rilevamento del movimento viene eseguito automaticamente l'uscita deve essere controllato per la precisione. Ci sono diverse ragioni per questo: uno è che ci sia spesso un sottostante, onde lente fluttuazione dei livelli di luce non legati al movimento del cuore. Questo di solito può essere eliminata mediante l'uso di una costruito nel filtro passa-alto. Una seconda ragione ha a che fare con la sensibilità del "Pixel per pixel" approccio. L'output di questo algoritmo è in genere due tracce movimento, uno per il movimento di contrazione e l'altra per il movimento relax. Nei vecchi mosche e in alcuni mutanti l'intervallo di tempo tra questi due movimenti diventa relativamente lunga e il programma cerca di interpretare i due movimenti separati come due battiti. Questo può essere corretto chiedendo al programma di confrontare l'output del Pixel da algoritmo di pixel con quella dell'algoritmo media Tenebre Frame, cliccando sul "buio Usa" scatola.
Esempio (vedi video): In 5 a 7 settimane vecchio vola intervalli sistolica sono in genere molto più a lungo nelle mosche giovani. Questi lunghi intervalli sono inizialmente rilevate come due contrazioni separate da un breve diastole. Questo può essere corretto selezionando l'opzione "Utilizza tenebre" casella di controllo. In questo caso il programma metterà a confronto l'intervallo diastolico identificato dal Pixel con algoritmo Pixel con l'uscita media Tenebre Frame. Se la produzione media tenebre Frame ha un valore positivo, allora ogni intervallo diastolico identificati nel Pixel con algoritmo Pixel saranno ignorati e gli intervalli saranno specificati correttamente. L'intero film possono essere acquisiti in 10 secondi segmenti e accettati (clicca su "OK Dati") o respinte (fare clic su "Elimina dati personali"). L'Hi e sensibilità passare Lo filtro può essere regolata manualmente per definire con maggiore precisione gli intervalli di contrazione quando utilizzano l'algoritmo Tenebre.
4. Statistiche di uscita-
Una volta che l'uscita di un film dato è stato accettato il programma utilizzerà queste informazioni per calcolare automaticamente una serie di parametri. Questi includono intervallo diastolica e sistolica, periodo cardiaco e la frequenza cardiaca, la direzione e la velocità delle FS onda contrazione, diametri cuore, e%. Inoltre, il programma ha diversi metodi per quantificare arrhythmicity riflettendo la contrazione non uniforme e cicli di rilassamento (vedi Fink et al, 2009). Prodotti statistici è previsto per ogni film individualmente e per l'intero set di dati nella forma di un valore separati da virgola (. Csv) che può essere aperto in programmi di foglio di calcolo come Microsoft Excel.
Tabella 1 -
Un esempio di output generato dal programma semi-automatico ottico Analisi Cuore.
5. Aggiornamento Istogrammi-
Questa parte del programma visualizza tutti i dati su intervalli di cuore per un set di dati in formato istogramma. Dal momento che le frequenze cardiache sono variabili abbiamo normalizzare i dati in uscita istogramma. Tuttavia, poiché la distribuzione degli intervalli non è simmetrica intorno a una media che utilizziamo il valore medio dell'intervallo per il nostro normalizzazione.
Esempio (vedi video): mosche mutanti che sono per il canale di potassio KCNQ mostrare intervalli diastolica e sistolica estremamente irregolare. Tipicamente gli intervalli sistolica sono molto più lunghi e più irregolare rispetto ai pari età vola tipo selvatico. Questo si può chiaramente vedere dalla visualizzazione dei dati in formato istogramma (vedi anche Ocorr et al. 2007).
6. M-mode-
Questo modulo genera M-modalità che possono essere fatte da qualsiasi posizione lungo il cuore nel frame del film. La lunghezza del M-mode possono anche essere specificata. M-modi sono utili per mostrare qualitativamente ciò che il cuore sta facendo in un film.
Esempio (vedi video): film di un cuore 3 giorni zebrafish vecchio larvale che mostra il ventricolo anteriore, che è usato per generare un M-mode. La fetta verticale di pixel che verranno trattati elettronicamente asportata da ogni fotogramma del film è indicato da una linea rossa.
M-mode Figura: Esempi di M-modalità di Drosophila e zebrafish. Una delle mutazioni miosina discusso nella fase della Pre-elabora i risultati in un motore molecolare con cinetica enzimatica più veloce con conseguente restrizione cuore e, occasionalmente, un blocco di conduzione. Entrambi i parametri possono essere visualizzati qualitativa, utilizzando M-modalità. 
M-modi di fatto nella stessa parte del cuore, sia tipo selvatico e mosche mutanti mostrano chiaramente il fenotipo limitato nel Mhc 5 mutante e il diametro dilatati e cicli di contrazione aritmica della D45 mutante (che esprime la miosina con cinetica enzimatica depresso) (modificato da Cammarato et. al, 2008).
M-mode fatto da un cuore Zebrafish larvale che mostra il ventricolo anteriore (film stesso cuore, come illustrato nella dimostrazione, Fink et al 2009).
7. Red Dot Movie-
Questo modulo genera automaticamente una rallentato (1:4), 20 seconda versione di un film analizzati esponendo tutti i pixel che sono identificati come cambia in rosso. Questa funzione viene utilizzata principalmente a scopo illustrativo.
Movie 1 - Un "movie punto rosso" che mostra i pixel che vengono identificati come i cambiamenti di intensità buio dagli algoritmi di programma in rosso. La velocità è rallentata dal film originale di un fattore 4.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Clicca qui per scaricare il filmato 1.
8. Applicazioni-aggiuntivo
Abbiamo iniziato ad applicare questo sistema di analisi per i film ad alta velocità di altri modelli con piccoli cuori che sono spesso difficili da analizzare con metodologia tradizionale. Noi abbiamo applicato con successo questa analisi sia per i cuori zebrafish larvale e cuori embrionali di topo (Fink et al, 2009).
Movie 2 - il cuore del film Topo più figura con intervalli di controllo con uscita dati.
Clicca qui per scaricare Movie 2. 
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Discussion
Il modello Drosophila ha dimostrato di essere un potente strumento genetico che è stato usato per affrontare una serie di quesiti scientifici che spaziano dallo sviluppo embrionale all'apprendimento e alla memoria. Di recente questo organismo modello versatile è stato utilizzato per studiare la genetica della funzione cardiaca. Un certo numero di tentativi di quantificare fisiologia cardiaca in adulti Drosophila si sono basati sulle osservazioni fatte nei moscerini intatta attraverso la cuticola addominale. La maggior parte di questi approcci dipendono osservazione visiva o registrazioni delle variazioni di intensità luminosa trasmessa attraverso l'addome a quantificare un unico parametro, la frequenza cardiaca. Anche se questo è un parametro utile è limitata a ciò che ci dice sulla funzione cardiaca. Il nostro semiautomatica ottico Metodo di analisi Heartbeat è un approccio robusto per ricavare informazioni precise su una serie di ulteriori parametri importanti da film ad alta velocità di battere i cuori e di farlo per ogni battito del cuore in un record.
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Acknowledgments
KO e AC sono supportati da una borsa e una borsa di studio della American Heart Association. SIB e RB sono sostenuti da sovvenzioni NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
