Summary
我々は、より高速の光記録を分析するための半自動化された光ビートの分析法（SOHA）を開発しました
Abstract
我々から高速光記録を分析するための方法を開発した
Protocol
半自動化されたハートビートの分析（SOHA）手順の概要を表示するにはここをクリック。
半自動の光ビートの分析
1。プリプロセス -
このステップでは、収縮期血圧および拡張期心径に関する情報を提供します。
ハートのエッジは最大拡張期と収縮期に識別し、マークされています。光学録音はさらに遅い速度と心臓の最大収縮と弛緩が発生したフレームの正確な同定を可能にする一度に1つのフレームに進めることができます。収縮期のエッジを識別する拡張期のエッジと一組の識別マークの一つのペアが作られています。マークは、心臓に沿って異なる水平位置で重複して行うこともできます。
このステップで得られた心臓の直径は、心臓の収縮性の推定値を提供する追加の測定を計算するために使用されています。この措置は、パーセント短縮率（％FS）であり、それは心の端が収縮しながらお互いに向かって移動する程度を表します。 ％FSを計算するために使用される数式は次のとおりです。
（（（拡張期直径 - 収縮期直径）/拡張期径）× 100）
注 - このセットで識別されたポイントは、直径と短縮率の測定にのみ使用され、動きの検出に使用されていません。
例 ：（。Cammarato、ら2008）ショウジョウバエ、ミオシン重鎖のトランスデューサのドメイン、それらがミオシンのATPase活性を抑制または増強するかどうかに応じて瞳孔が開いたり、制限されている心の中でその結果、モータの酵素活性を調節することが知られている地域での点変異で。これらの測定値の種類は、キューティクルと脂肪によって、心臓の管の全長に沿って心臓のエッジを識別するために、通常は不可能であるとして、そのままハエで作ることができない、（野生型を比較し、D45とMhc5"M -モードでM -モード通常、心臓を取り巻く以下の図"）。他の一般的に用いられる方法で無傷のハエに心臓を視覚化する際に行われた測定は通常、心臓の最も前方部分、円錐状のチャンバーの領域に制限されています。それは、固定組織でこの動的な測定値を得ることも不可能です。
2。動きの検出 -
このステップはプログラムによって自動的に行われ、各映画での動きを分析するために二つの異なるアルゴリズムを使用しています。簡単に言えば、最初のアルゴリズムは、"平均フレームの闇"アルゴリズムは、フレームのアプローチによってフレームを使用しています。このアルゴリズムの平均ムービー全体のフレームのための暗闇の強度は、0と1の間の間隔に値を正規化し、プロット時間をかけて映画の中ですべてのフレームのための正規化平均。二つ目のアプローチ、"ピクセル単位"のアルゴリズムは、次のフレームへのすべての個々のピクセルの暗さの変化を分析する。プリセットしきい値以上の強度の変化を示す画素は、フレームごとに加算され、時間をかけて映画の中でフレームごとにプロットされます。
3。間隔をチェックする
two動き検出アルゴリズムからの出力は、出力ウィンドウに"ピクセル単位"上記のウィンドウに表示される"平均闇"出力でこのモジュールに表示されます。検出間隔は、我々が直接アルゴリズムの出力ウィンドウの下に分析されるフレームから作られた、エッジトレースまたはMモードを表示する実際の映画の中での動きと一致することを確実にするために。 Mモードは、デジタルムービー内の各フレームから心臓を介して1つのピクセル幅のスライスをカットし、時間をかけて心臓のエッジの動きのスナップショットを提供するために、水平方向に整列させることにより行われます。ウィンドウ"ピクセル単位"で識別される拡張期区間は、直接上記のその間隔に寄与するフレームの数と水平の緑の線で示されます。収縮の間隔は、2つの連続するdiastoles間の間隔として識別されます。収縮期の始まりは、縦の赤い線で示されている青色の縦線と年末までに、M -モードで表示されます。このディスプレイではそれは、アルゴリズムの出力は、実際の心臓の動きと一致しているかどうかを確認することは比較的容易です。
動きの検出が自動的に実行されますが、出力は精度をチェックする必要があります。これにはいくつかの理由があり、1つは、心臓の動きに関連していない光のレベルでの基礎と、徐波の変動がないことがあります。これは通常、ハイパスフィルタを内蔵を使用することによって排除することができます。第二の理由は、アプローチ"ピクセル単位"の感度に関係しています。このアルゴリズムからの出力は通常、2つの動きのトレース、収縮運動用と緩和の動きの一つです。これら二つの動きの間の時間の長さは古いハエで、いくつかの変異体で比較的長くなり、プログラムは2つの別々のビートとして2つの動きを解釈しようとします。これは、"使用の闇"ボックスをクリックして、平均フレームの闇のアルゴリズムのものとピクセルアルゴリズムにより、画素の出力を比較するプログラムを尋ねることによって修正することができます。
例（ビデオを参照してください）：古い5〜7週間で収縮の間隔は一般的に若いハエよりもはるかに長い飛ぶ。これらの長い間隔は、最初に短い拡張期で区切られた2つの別個の収縮として検出されます。これは、"使用の闇"のチェックボックスを選択して修正することができます。この場合、プログラムは、平均フレーム闇の出力を持つピクセルアルゴリズムによってピクセルで識別される拡張期の間隔を比較します。平均フレーム闇の出力が正の値を持つ場合、そのピクセルのアルゴリズムによってピクセルで識別されるすべての拡張期の間隔は無視され、間隔が正しく指定されます。映画全体は、10秒のセグメントでスキャンされ、受け入れ（"OKデータ"をクリック）または（"データを破棄する"をクリックして）拒否することができます。 HiとLoパスフィルタ感度は、手動で闇のアルゴリズムを採用するときに収縮の間隔を定義する、より正確にできるように調整することができます。
4。出力の統計 -
特定の映画のための出力が受理されたら、プログラムは自動的にパラメータの数を計算するためにその情報を使用します。これらは、収縮の波、心臓の直径、および％FSの方向と速度を収縮期血圧および拡張期区間、心臓周期と心拍数が含まれています。さらに、プログラムは不均一な収縮と弛緩のサイクルを反映しarrhythmicityを定量化するための複数のメソッドが用意されています（フィンクら、2009参照）。統計的な出力は、個別にそれぞれの映画のために、Microsoft Excelなどのスプレッドシートプログラムで開くことができるカンマ区切り値（。csv）ファイルの形式でデータセット全体に対して提供されています。
表1 -
半自動化された光学ハートの解析プログラムによって生成される出力の例。
5。アップデートヒストグラム-
プログラムのこの部分はヒストグラムの形式でデータセットの中心の間隔でデータがすべて表示されます。心拍数が可変であるため、我々は、ヒストグラムの出力データを正規化する。しかし、間隔の分布は、当社の正規化のための平均間隔の値を使用して、平均の周りの対称ではありません。
例（ビデオを参照してください）：KCNQカリウムチャネルの変異であるハエは非常に不規則な収縮期血圧および拡張期の間隔を示す。一般的に収縮の間隔は、はるかに長いと年齢をマッチさせた野生型のハエよりも不規則である。これは、明らかに（Ocorrらも参照してください。2007）ヒストグラム形式でデータを表示することで見ることができます。
6。 M -モード
このモジュールは、ムービーフレームの中心に沿って任意の位置から作ることができるM -モードを生成します。 M -モードの長さを指定することもできます。 M -モードは心臓が映画の中で何をしているかを定性的に表すのに便利です。
例（ビデオを参照してください）：M -モードを生成するために使用される前心室を示す3日間の古いゼブラフィッシュの幼虫の心臓の動画。電子的に各ムービーフレームから切り出される画素の垂直方向のスライスは、赤線で示されます。
Mモード図 ：ショウジョウバエとゼブラフィッシュからM -モードの例。心臓の制限と時折伝導ブロックを伴う高速化酵素の反応速度論と分子モーターで、前処理段階の結果で説明したミオシンの突然変異の1つ。両方のパラメータが定性的にM -モードを使用して表示することができます。 
野生型と変異体のハエの両方の心の同じ部分で行われたM -モードは明らかに修正された（（抑うつ酵素の反応速度とミオシンを発現する）MHC 5変異体と拡張型心筋径とD45変異体の不整脈の収縮サイクルに制限された表現型を示すCammaratoら、2008年から）。
前室（デモ、フィンクet.al.、2009年に示したものと同じ心の映画）を示すゼブラフィッシュ幼生の心臓から作られたM -モード。
7。レッドドットのムービー -
このモジュールは自動的に赤色に変化するとして識別されるすべてのピクセルを示す分析した映画の鈍化（1:4）、20秒バージョンを生成します。この機能は主に、説明の目的で使用されています。
ムービー1 -赤のプログラムのアルゴリズムによって暗さの強度の変化を持つものとして識別されるピクセルを示す"赤いドットの映画"。ムービーの速度を4倍に元から遅くなる。
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.aviは">動画1をダウンロードするには、ここをクリック。
8。追加のアプリケーション -
私たちはしばしば伝統的な方法論を用いて分析することが困難な小さな心で他のモデルのハイスピードムービーにこの分析システムを適用し始めている。私たちは正常にゼブラフィッシュ幼生の心とマウス胎児の心臓（フィンクら、2009）の両方にこの分析を適用している。
ムービー2 -データの出力とチェックの間隔でマウスの心臓のムービープラスの図。
ムービー2をダウンロードするには、ここをクリック。 
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Discussion
ショウジョウバエモデルでは、胎生発育から学習や記憶に至るまで、科学的なさまざまな質問に対処するために使用されている強力な遺伝学的ツールであることが証明されている。最近この多目的なモデル生物は、心臓機能の遺伝学を調査するために使用されています。成体ショウジョウバエで心臓生理学を定量化するための試行回数は、腹部のクチクラを通してそのままハエで行った観測に頼ってきた。これらのアプローチのほとんどは、単一のパラメータ、心拍数を定量化するために腹部を透過した光強度の変化を目視や録音によって異なります。これは有用なパラメータですが、それはそれは心臓の機能について教えてくれるものに限られている。私たちの半自動化された光ビートの分析方法は、レコード内のすべてのハートビートのためにそうする心を破っての高速ムービーからの追加の重要なパラメータの数に関する正確な情報を導出するための堅牢なアプローチです。
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Acknowledgments
KOとACは、米国心臓協会からの助成金やフェローシップでサポートされています。 SIBとRBは、NIHからの補助金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
