Summary
Мы разработали Полуавтоматическая Оптический метод анализа Heartbeat (Соха) для анализа высокоскоростных оптических записи с
Abstract
Мы разработали метод анализа высокоскоростных оптических записи с
Protocol
Нажмите здесь, чтобы посмотреть обзор полу автоматизированной сердцебиение анализа (Соха) процедуры.
Полуавтоматическая оптического анализа сердцебиение
1. Предварительная обработка -
Этот шаг дает информацию о диастолического и систолического диаметров сердце.
Сердце края были выявлены и отмечены во время максимального диастолу и систолу. Оптический записи могут быть выдвинуты на медленной скорости и даже один кадр в тот момент, позволяющая точно идентифицировать кадры, где максимальное сокращение и расслабление сердца происходят. Одна пара марок определения диастолического краям и одна пара определения систолического краями выполнены. Знаки также может быть составлен в двух экземплярах в разных местах вдоль горизонтальной сердце.
Сердце диаметров, полученных в этом шаге также используется для расчета дополнительных измерений, что позволяет оценить сократительную способность сердца. Эта мера процентов фракции укорочения (% FS) и представляет собой степень, в которой сердце краям движутся навстречу друг другу во время сокращения. Формула для расчета% FS является:
(((Диастолическое диаметр - систолическое диаметре) / Диастолическое диаметр) х 100)
Примечание - точки, определенные в этот набор, используются только в диаметре и дробные измерения сокращения и не используются для обнаружения движения.
Пример: (. Cammarato и др. 2008) В дрозофилы, точечных мутаций в преобразователь домена тяжелой цепи миозина, в области, известной для модуляции ферментативной активности двигателя, приводит к сердцам, расширены или ограничены в зависимости от того, они подавляют или усилить АТФазы миозина в . Эти типы измерений не могут быть сделаны в интактных мухи, как это обычно невозможно определить сердце ребер вдоль всей длины сердце трубку, через кутикулу и жира, (сравните дикого типа, D45 и Mhc5 М-мод в "М-режим Рис "ниже), которые обычно окружают сердце. Измерения, проведенные при визуализации сердца в интактных мух других широко используемых методов, как правило, ограничивается самой передней части сердца, коническая область камеры. Он также не удалось получить эту динамических измерений в основной ткани.
2. Датчики движения-
Этот шаг делается автоматически с помощью программы и использует две различные алгоритмы для анализа движения в каждом фильме. Одним словом, первый алгоритм, "Средняя Frame Darkness" Алгоритм использует кадр за кадром подход. Этот алгоритм средние темноты интенсивность для всего кадра фильма, нормализует значение интервала между 0 и 1, и сюжеты нормированного среднем для каждого кадра в фильме с течением времени. Второй подход, "пиксель за пикселем" алгоритм, анализирует изменения в темноте всех отдельных пикселов от одного кадра к другому. Пиксели, которые показывают изменение интенсивности выше установленного порога, суммируются для каждого кадра и построены для каждого кадра в фильме с течением времени.
3. Проверьте Интервалы-
Выход из двух алгоритмов обнаружения движения отображается в этом модуле с "Средняя Darkness" выход отображается в окне выше "пиксель за пикселем" окна вывода. Для того, чтобы быть уверенным, что обнаружение согласен с интервалом движения в фактических фильме мы показываем края трассы или М-режим из кадров анализируемых прямо под окнами алгоритм вывода. М-режим осуществляется цифровой резки ломтиками шириной в один пиксель через сердце от каждого кадра в фильме и приведения их в горизонтальном предоставить снимок сердца край движения с течением времени. В "пиксель за пикселем" окно определены диастолический интервалы обозначены горизонтальная зеленая линия с количеством кадров, способствующих этому интервалу непосредственно выше. Систолическое интервалы определяются как интервал между двумя последовательными diastoles. Начале систолы указывается в М-режиме по вертикальной синей линии и в конце указывается вертикальной красной линии. С этого дисплея можно относительно легко увидеть, если алгоритм выхода согласуется с фактическим движениям сердца.
Хотя обнаружение движения выполняется автоматически выход должен быть проверен на точность. Есть несколько причин для этого, является то, что зачастую основной, медленное колебание волны в уровне освещенности, не связанные с сердцем движения. Обычно это может быть устранена путем использования встроенных в фильтр высоких частот. Вторая причина связана с чувствительностью "пиксель за пикселем" подход. Выход из этого алгоритма, как правило, два движения следы, по одному для сокращения движения и один для релаксации движения. В старых мух, а в некоторых мутантов промежуток времени между этими двумя движениями становится относительно длинные и программа пытается интерпретировать два движения в виде двух отдельных битов. Это можно исправить, задав программу для сравнения вывод пиксель за пикселем алгоритм с деятельностью Средняя алгоритм тьмы Frame, нажав на "Использовать темноту" коробка.
Пример (см. видео): В 5 до 7 неделя мухи систолического интервалах, как правило, гораздо дольше, чем у молодых мух. Эти длинные интервалы первоначально обнаружен в виде двух отдельных сокращений, разделенных короткими диастолы. Это можно исправить, выбрав опцию "Использовать темноту" флажок. В этом случае программа будет сравнивать диастолического интервал, выраженный пиксель за пикселем алгоритм с Средняя производительность Тьмы Frame. Если средний выход Тьмы Frame имеет положительное значение, то любой диастолического интервала определены в пиксель за пикселем алгоритм будет проигнорирована и интервалы будут правильно указаны. Весь фильм можно сканировать в 10 секунд сегментов и принята (нажмите кнопку "OK данных") или отклонен (нажмите "Отменить данные"). Привет и Ло фильтр чувствительности может быть скорректирована вручную, чтобы помочь более точно определить сокращение интервалов при использовании алгоритма Тьмы.
4. Выходной Статистика-
После выхода для данного фильма была принята программа будет использовать эту информацию для автоматического расчета количества параметров. К ним относятся диастолического и систолического интервала, сердце периода и частоты сердечных сокращений, направления и скорости сокращения FS волна, сердце диаметров и%. Кроме того, программа имеет несколько методов для количественного arrhythmicity отражает неоднородный сокращения и расслабления циклов (см. Финк и др., 2009). Статистический вывод осуществляется для каждого фильма в отдельности и для всего набора данных в виде значения, разделенные запятыми (. CSV) файл, который может быть открыт в таблицу программ, таких как Microsoft Excel.
Таблица 1 -
Примером вывод, генерируемый Полуавтоматическая Оптический программы анализа Сердце.
5. Обновление Гистограммы-
Эта часть программы отображаются все данные на сердце интервалов для набора данных в формате гистограммы. Поскольку ЧСС являются переменными мы нормализуем гистограммы выходных данных. Однако из-за распределения интервалов не симметрично вокруг означает, что мы использовать среднее значение интервала для наших нормализации.
Пример (см. видео): мух, которые мутанта для KCNQ калиевого канала показывают крайне неравномерно диастолического и систолического интервалами. Обычно систолическое интервалы гораздо дольше и более нерегулярным, чем в подобранных по возрасту мух дикого типа. Это можно ясно увидеть, отображая данные в формате гистограммы (см. также Ocorr и соавт. 2007).
6. М-режим-
Этот модуль генерирует М-режимов, которые могут быть сделаны из любого положения по сердцу в фильме кадр. Длина М-режим также может быть указан. M-режимы полезно показать качественно, что сердце делает в фильме.
Пример (см. видео): Фильм о 3-х дневный старые данио личиночной сердце показывает передний желудочек, который используется для генерации М-режиме. Вертикальный срез пикселей, которые будут электронном вырезали из каждого кадра обозначен красной линией.
М-режим Рисунок: Примеры М-режимов от дрозофилы и рыбок данио. Один из миозина мутации обсуждается в шаге предварительной обработки результатов в молекулярной двигателя с более быстрой кинетикой фермента приводит к сердцу ограничения, а иногда и проводниковая анестезия. Оба параметра можно показать качественно использованием М-режимах. 
М-режимах выполнен в том же часть сердца в обеих дикого типа и мутантных мух ясно показывают ограниченный фенотип MHC 5 мутанта и расширенные диаметров и аритмической циклов сокращения D45 мутант (которая выражает миозина с депрессией кинетики ферментов) (Изменено от Cammarato и др.. др., 2008).
М-режим из данио рерио личиночной сердце показывает передней желудочка (одноименного фильма сердце, как показано на демонстрации, Финк et.al. 2009).
7. Red Dot Movie-
Этот модуль автоматически производит замедлился (1:4), 20 второй версии проанализировал фильм, показывающий все пиксели, которые определены как изменения в красный цвет. Эта функция используется в основном для иллюстрации.
Фильм 1 - "красная точка фильм" показывает пиксели, которые определены как изменения темноты интенсивность программных алгоритмов в красный цвет. Фильм скорость замедляется с оригинала в 4 раза.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 1.
8. Дополнительные приложения-
Мы начали применять эту аналитическую систему для фильмов высокой скорости других моделей с небольшими сердца, которые часто трудно анализировать, используя традиционные методики. Мы успешно применили этот анализ как данио личиночной сердца и эмбрионального сердца мыши (Финк и др., 2009).
Фильм 2 - Мышь фильм сердце плюс фигура с интервалом проверки с выходом данных.
Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 2. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель Drosophila оказался мощный генетический инструмент, который был использован для решения различных научных вопросов, начиная от эмбрионального развития к обучению и память. В последнее время этот универсальный организм модели был использован для исследования генетики функции сердца. Количество попыток количественно сердце физиологии во взрослой дрозофилы полагались на наблюдениях, сделанных в интактных летит через брюшную кутикулы. Большинство из этих подходов зависит от визуального наблюдения или записи изменений в интенсивности света, прошедшего через живот, чтобы количественно один параметр, частоту сердечных сокращений. Хотя это и полезный параметр он ограничен в том, что оно говорит нам о функции сердца. Наши Полуавтоматическая Оптический метод анализа Heartbeat является надежным подходом для получения точной информации о ряд дополнительных важных параметров от фильмов высокой скорости бьющимся сердцем и делать это для каждого сердцебиения в записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
КО и переменного тока, поддерживаются грантов и стипендий, начиная с Американской ассоциации сердца. SIB и РБ, поддерживаются грантами NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
