Summary
Deze video laat zien en vergelijkt twee experimentele modellen te bestuderen van de ontwikkeling van obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) in muizen, de heterotope en orthotope tracheale transplantatie model.
Abstract
Obliterans luchtwegen ziekte (OAD) is de belangrijkste complicatie na longtransplantaties die lange termijn overleving (1-7) grenzen.
De studie van de pathofysiologie, zijn behandeling en preventie van OAD, verschillende diermodellen van tracheale transplantatie in knaagdieren ontwikkeld (1-7). Hier gebruiken we twee bestaande modellen van luchtpijp transplantatie, de heterotope en orthotope model en blijk geven van hun voordelen en beperkingen.
Voor de heterotope model, is de donor luchtpijp verpakt in de grotere omentum van de ontvanger, terwijl de donor luchtpijp wordt geanastomoseerd door de end-to-end anastomose in de orthotope model.
In beide modellen, heeft de ontwikkeling van obliteratieve laesies histologische overeenkomend met klinische OAD aangetoond (1-7).
Deze video laat zien hoe uit te voeren zowel de heterotope evenals de orthotope tracheale transplantatie techniek in muizen, en vergelijkt het tijdsverloop van OAD ontwikkeling in zowel modellen met histologie.
Protocol
- Man Balb / C-muizen (8-12 weken) worden gekocht van Charles River Laboratories (Sulzfeld, Duitsland). De muizen zijn gehuisvest onder gangbare condities, gevoed standaard muizen voedsel en water ad libitum.
- 2% Isofluran wordt gebruikt voor anesthesie.
DONOR VOORBEREIDING
- Scheren van de buik haar en desinfecteren van de omgeving met behulp van betaisodona.
- Bij microscopisch bekijken, voert u een middellijn cervicale incisie van het niveau van het strottenhoofd aan het borstbeen.
- Verwijder het onderhuidse vet en de band spieren om een duidelijk beeld van de luchtpijp te krijgen.
- Ontleden de luchtpijp van een omliggende weefsels, zoals de slokdarm, zenuwen, bloedvaten en het bindweefsel.
- Verwijder de hele luchtpijp (van het strottenhoofd naar de bifurcatie).
- Spoel de transplantatie met koud zout en bewaar het transplantaat bij 4 ° C.
- De donor is gedood door cervicale dislocatie na de oogst van de luchtpijp.
Ontvanger: heterotope TRANSPLANTATIE
- Scheren van de buik haar in een ruime marge rond de incisie en desinfecteer het gebied drie keer met betaisodona (betadine), gevolgd door alcohol. Ogen moeten worden gesmeerd met een oogzalf product aan de hoornvliezen niet uitdrogen.
- Voer een mediane laparotomie en plaats de darm in een steriele, moistured handschoen.
- Zorgvuldig Spreid de grotere omentum. Plaats het transplantaat in het midden en fixeer het met een enkele hechting met 8-0 (Prolene, Ethicon, Duitsland).
- Volledig te dekken van de transplantatie met de grotere omentum en bevestig het transplantaat met een enkele hechting 8-0 (Prolene, Ethicon, Duitsland).
- Terug verplaatsen van de darmen in de buik en vóór spoelen met warm, steriele zoutoplossing aan de sluiting.
- Close-up in 2 lagen - buikwand en de huid laag met doorlopend patroon met 7-0 Prolene voor de spier en 7-0 Vicryl voor de huid.
Ontvanger: orthotope TRANSPLANTATIE
- Scheren van de buik haar in een ruime marge rond de incisie en desinfecteer het gebied drie keer met betaisodona (betadine), gevolgd door alcohol. Ogen moeten worden gesmeerd met een oogzalf product aan de hoornvliezen niet uitdrogen.
- Verdeel de band spieren om de hele laryngotracheale complex te visualiseren.
- Zorgvuldig ontleden de luchtpijp van de omliggende weefsels, zorg om de steeds terugkerende larynx zenuwen te behouden.
- Verdeel de luchtpijp drie ringen caudaal van de cricoid. Het dier houdt fysiologische ademhaling via de tracheostomie.
- Zorgen voor een schone tracheale randen in de ontvanger als in het transplantaat.
- De ent wordt geplaatst tussen de ontvanger tracheale gebreken en georiënteerd op anatomische polariteit.
- Met behulp van 8-0 (Prolene, Ethicon, Duitsland) anastomose de donor transplantaat met het distale (mediastinale) luchtpijp. Het achterste deel van de anastomose wordt uitgevoerd in continu bedrijf mode. De voorste aspect wordt dan ingevuld met behulp onderbroken steken.
- Verwijder eventuele afscheiding uit de luchtwegen.
- De proximale anastomose wordt dan afgerond op dezelfde manier als de distale een.
- Zorg ervoor dat de integriteit van de luchtweg en adequate, spontane ademhaling.
- Verplaats de riem spieren en sluit het onderhuidse weefsel en de huid laag met 6-0 hechtingen (Vicryl, Ethicon, Duitsland) met doorlopend patroon.
- Gebruik injectie anesthesie voor de ontvanger, dus het dier zal fysiologische ademhaling te behouden door de luchtpijp. Een combinatie van 75/1/0.2 mg / kg propofol, medetomidine en fentanyl, respectievelijk, wordt gebruikt voor ip anesthesie bij muizen.
Figuur 1: Donor luchtpijp.
1A: Donor luchtpijp in situ na bereiding.
1B: weggesneden donor luchtpijp.
1C: Donor luchtpijp na explantatie.
Figuur 2: Heterotope Model.
2A: Het transplantaat is gepositioneerd in het midden van de grotere omentum.
2B: Het transplantaat is vast aan beide uiteinden met een hechtdraad.
2C: Het transplantaat is verpakt in de grotere omentum en gefixeerd met een hechting.
Figuur 3: orthotope Model.
3A: De ent wordt geplaatst tussen de ontvanger tracheale gebreken en de achterste muur is geanastomoseerd in continu bedrijf mode.
3B: De voorste muur is ingevuld met behulp van een hechtdraad.
Figuur 4: Histologie.
4A: Herstelde heterotope getransplanteerd luchtpijp na 28 dagen in de H + E staining (15x). Let op de 100% luminale vernietiging.
4B: Herstelde orthotope transplantatie luchtpijp na 60 dagen in de H + E kleuring (15x). Maximale bereikt luminale vernietiging is ongeveer 45%.
| Heterotope Tracheale Transplantatie Model | Orthotope Tracheale Transplantatie Model | |
| Voordelen | + Makkelijk uit te voeren + Luminal obliteratie met volledige luchtwegen occlusie na 28 dagen + Geen fysieke affectie van dieren door de OAD | + Fysieke ventilatie van het transplantaat + Geïnhaleerde toediening van het geneesmiddel mogelijk + Sterke immunologische reacties zoals alloreactieve IgM productie van antilichamen + Fysiologische thoracale milieu + Tracheale-tracheale anastomose imiteert de klinische setting |
| Nadelen | - Geen ventilatie van getransplanteerde trachea - Geen evaluatie van ingeademde ziekteverwekkers mogelijk - Remming van mucociliaire klaring en behield afscheidingen - Peritoneale micro-omgeving in plaats van thoracale milieu | - Chirurgische opleiding nodig - Luminal obliteratie met luminal occlusie app. 45% na 60 dagen - Dieren kunnen ontwikkelen symptomen van OAD |
Tabel 1: Voordelen en nadelen van Heterotope en orthotope tracheale transplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muizen zijn verkrijgbaar in verschillende transgeneic en knockout model, en dus geschikt om mechanistische vragen met betrekking tot OAD (4) te bestuderen.
Beide modellen van tracheale transplantatie in deze video kan gebruikt worden als betrouwbare modellen voor het bestuderen van OAD ontwikkeling.
Echter, elk model demonstreert voordelen en beperkingen.
De heterotope tracheale transplantatie is eenvoudig uit te voeren en vereist geen speciale chirurgische opleiding (3, 5). Na heterotope transplantatie, zal luminale obliteration optreden snel en volledig de luchtwegen occlusie verschijnt na 28 dagen (3, 4, 6). Dieren zijn niet fysiek beïnvloed door de OAD ontwikkeling, omdat hun organisme is niet afhankelijk van de heterotope getransplanteerde luchtpijp.
Een nadeel is het gebrek aan ventilatie van de getransplanteerde luchtpijp (7, 6), daarom is het niet mogelijk het evalueren van de invloed van de ingeademde ziekteverwekkers (3, 7). Als gevolg van de remming van mucociliaire klaring en behield afscheidingen van de resultaten kunnen afwijken van fysiologische reacties gezien in klinische OAD (7). De peritoneale micro-omgeving verschilt van de thoracale milieu, die ook kan leiden tot gewijzigde resultaten (3).
Voor het uitvoeren van de orthotope transplantatie tracheale chirurgische opleiding is noodzakelijk en luminale vernietiging van de getransplanteerde luchtpijp verschijnt na 60 dagen in plaats van 28 dagen in de heterotope model (3, 7). Ook maximale bereikt luminale obliteratie is app. 45% in plaats van 100% in de heterotope model (3, 7). Echter, in de orthotopische model, wordt fysiologische ventilatie verkregen en geïnhaleerde toediening is mogelijk (3). Immunologische respons, zoals alloreactieve IgM-productie van antilichamen is aangetoond dat veel sterker in dit model dan de heterotope model (3). De tracheale-tracheale anastomose en de reacties op deze site zijn meer vergelijkbaar met de anastomose uitgevoerd in de kliniek (7).
Voordelen en beperkingen van elk model worden in detail weergegeven in tabel 1.
Kortom, deze video laat zien dat zowel de heterotope evenals de orthotope tracheale transplantatie techniek in muizen kunnen worden gebruikt als reproduceerbaar en betrouwbare modellen te OAD studeren.
Echter moet het model worden gekozen zorgvuldig afhankelijk van de fundamentele vraag van het onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sonja Schrepfer heeft een onderzoekssubsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-1).]
Alle dieren kregen menselijke zorg in overeenstemming met de beginselen van het Laboratory Animal Care, werden experimenten op dieren uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Nationale Vereniging voor Medisch onderzoek en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health (National Institutes of Health publicatie 85-23, herzien 1985).
Alle dieren werden verkregen van Charles River Laboratories (Sulzfeld, Duitsland) en werden gehouden in het dier opvang van het Universitair Ziekenhuis Hamburg Eppendorf. De dieren kregen standaard chow en water ad libitum.
Acknowledgments
De auteurs danken Christiane Pahrmann (Lab Manager).
References
- Adams, B., Berry, G., Huang, X., Shorthouse, R., Brazelton, T., Morris, R. Immunosuppressive therapies for the prevention and treatment of obliterative airway disease in heterotopic rat trachea allografts. Transplantation. 69, 2260-2266 Forthcoming.
- Adams, B., Brazelton, T., Berry, G., Morris, R. The role of respiratory epithelium in a rat model of obliterative airway disease. Transplantation. 69, 661-665 Forthcoming.
- Deuse, T., Schrepfer, S., Reichenspurner, H., Hoyt, G., Fischbein, M., Robbins, R., Pelletier, M. Techniques for experimental heterotopic and orthotopic tracheal transplantations – when to use which model; Transplant Immunology 17. , 255-261 (2007).
- Hele, D., Yacoub, M., Belvisi, M. The heterotopic tracheal allograft as an animal model of obliterative bronchiolitis. Respiratory Research. 2, 169-183 Forthcoming.
- Hertz, M., Jessurun, J., King, M., Savic, S., Murray, J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American Journal of Pathology. 142, (1993).
- McDyer, J. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proceedings of the American Thoracic Society. 4, 37-43 Forthcoming.
- Schrepfer, S., Deuse, T., Hoyt, G., Sheikh, A., Hoffmann, J., Reichenspurner, H., Robbins, R., Pelletier, M. Experimental orthotopic tracheal transplantation: the stanford technique. Microsurgery. 27, 187-189 (2007).
