Summary
Denna video visar och jämför två experimentella modeller för att studera utvecklingen av obliterativ luftvägssjukdom (OAD) i möss, heterotopisk och orthotopic luftstrupen transplantation modell.
Abstract
Obliterativ luftvägssjukdom (OAD) är den största komplikationen efter lungtransplantationer som begränsar långsiktiga överlevnad (1-7).
För att studera patofysiologin har behandling och förebyggande av OAD, olika djurmodeller för trakeal transplantation hos gnagare har utvecklats (1-7). Här använder vi två etablerade modeller av luftstrupen transplantation av heterotopisk och orthotopic modell och visa deras fördelar och begränsningar.
För heterotopisk modellen givaren luftstrupen insvept i större omentum för mottagaren, medan givaren luftstrupen är anastomoseras av end-to-end anastomos i orthotopic modellen.
I båda modellerna, har utvecklingen av obliterativ lesioner histologiska liknande kliniska OAD visats (1-7).
Denna video visar hur du utför båda, jämför heterotopisk liksom orthotopic trakeal transplantation teknik i möss, och den tid under OAD utveckling i både modeller med histologi.
Protocol
- Man BALB / c möss (8-12 veckor) köps från Charles River Laboratories (Sulzfeld, Tyskland). Mössen blir förvarade under vanliga förhållanden, utfodras standard möss mat och vatten ad libitum.
- 2% Isofluran används för anestesi.
GIVARE FÖRBEREDELSER
- Raka buken håret och desinfektera området med hjälp betaisodona.
- Enligt mikroskopiska visa, utföra en mittlinjen livmoderhalscancer snitt från nivån i struphuvudet till bröstbenet.
- Ta bort underhudsfett och musklerna remmen för att få en tydlig bild av luftstrupen.
- Dissekera luftstrupen från alla omgivande vävnader, som i matstrupen, nerver, artärer och bindväv.
- Ta bort hela luftstrupen (från struphuvudet till bifurkation).
- Spola transplantation med kall saltlösning och lagra transplantat vid 4 ° C.
- Givaren är avlivas genom halsdislokation efter skörden av luftstrupen.
Mottagare: heterotopisk TRANSPLANTATION
- Raka buken håret i en bred marginal runt snittet webbplatsen och desinfektera området tre gånger med betaisodona (Betadine) följt av alkohol. Ögonen ska smörjas med ett ögonläkemedel salva produkt för att förhindra att hornhinnor från att torka ut.
- Gör en median laparotomi och placera tarmen i en steril, moistured handske.
- Sprid större omentum noggrant. Placera transplantat i mitten och fixera det med en enda sutur med 8-0 (Prolene, Ethicon, Tyskland).
- Fullt täcka transplantatet med större omentum och fixa transplantat med en enda sutur 8-0 (Prolene, Ethicon, Tyskland).
- Flytta tarmen tillbaka in i buken och spola med varmt, steril koksaltlösning före stängning.
- Närbild på 2 lager - bukväggen och hudlagret med kontinuerliga mönster med 7-0 Prolene för muskler och 7-0 Vicryl för huden.
Mottagare: ORTHOTOPIC TRANSPLANTATION
- Raka buken håret i en bred marginal runt snittet webbplatsen och desinfektera området tre gånger med betaisodona (Betadine) följt av alkohol. Ögonen ska smörjas med ett ögonläkemedel salva produkt för att förhindra att hornhinnor från att torka ut.
- Dela remmen musklerna att visualisera hela laryngotracheal komplex.
- Försiktigt dissekera luftstrupen från den omgivande vävnader, vara noga med att bevara den återkommande larynx nerverna.
- Dela luftstrupen tre ringarna caudal från cricoid. Djuret upprätthåller fysiologiska andning via trakeostomi.
- Se till att rena luftrör kanter i mottagaren och i transplantatet.
- Transplantatet inträder mellan mottagaren trakeala defekter och orienterad för att bibehålla anatomisk polaritet.
- Använda 8-0 (Prolene, Ethicon, Tyskland) anastomose givaren transplantat med den distala (mediastinum) luftstrupen. Den bakre delen av anastomos görs i kontinuerlig drift mode. Den främre aspekten är då klar med avbruten stygn.
- Ta bort alla sekret från luftvägarna.
- Den proximala anastomos är ifyllda på samma sätt som den distala en.
- Säkerställa integriteten av luftvägarna och tillräcklig, spontan andning.
- Flytta remmen muskler och stäng subkutan vävnad och hud lager med 6-0 suturer (Vicryl, Ethicon, Tyskland) med kontinuerlig mönster.
- Använd injektion anestesi för mottagaren, därför djuret kommer att behålla fysiologiska andning genom luftstrupen. En kombination av 75/1/0.2 mg / kg av propofol, medetomidin och fentanyl, respektive, används för IP anestesi hos möss.
Figur 1: Donor luftstrupen.
1A: Donator luftstrupen på plats efter beredning.
1B: censurerade donator luftstrupen.
1C: Donator luftstrupen efter borttagning.
Figur 2: Heterotopisk Model.
2A: Det transplantat är placerad i centrum av den större omentum.
2B: Den transplantat är fast i båda ändarna med en enda sutur.
2C: De transplantat är insvept i större omentum och fixeras med en enda sutur.
Figur 3: Orthotopic Model.
3A: Den transplantat inträder mellan mottagaren trakeala defekter och den bakre väggen anastomoseras i kontinuerlig drift mode.
3B: Den främre väggen är klar med en enda sutur.
Figur 4: Histologi.
4A: Återvunnen heterotopisk transplanterade luftstrupen efter 28 dagar i H + E STAansvara för prövningen (15x). Notera 100% luminala utplåning.
4B: Återvunnen orthotopic transplanterade luftstrupen efter 60 dagar i H + E färgning (15x). Maximal uppnås luminala utplåning är ca 45%.
| Heterotopisk Trakealtuber Transplantation Modell | Orthotopic Trakealtuber Transplantation Modell | |
| Fördelar | + Lätt att utföra + Luminala utplåning med komplett luftvägarna ocklusion efter 28 dagar + Ingen fysisk påverkan av djur genom OAD | + Fysisk ventilation av transplantat + Inhalerat Drug Administration möjligt + Starka immunologiska reaktioner såsom alloreactive IgM-antikroppar + Fysiologiska bröstkorg miljö + Trakealtuber-trakeal anastomos imiterar klinisk miljö |
| Nackdelar | - Ingen ventilation av transplanterade luftstrupen - Ingen utvärdering av inhalerade patogener möjligt - Hämning av mucociliary clearance och behållas sekret - Peritoneal mikromiljö istället för bröst-miljö | - Kirurgiska utbildning som krävs - Luminala utplåning med luminala ocklusion app. 45% efter 60 dagar - Djur kan utveckla symtom på OAD |
Tabell 1: Fördelar och nackdelar med Heterotopisk och Orthotopic Trakealtuber Transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Möss finns i olika transgeneic och knockout modell, och därför lämpligt att studera mekanistiska frågor relaterade till OAD (4).
Båda modellerna av trakeal transplantation som visas i denna video kan användas som tillförlitliga modeller för att studera OAD utveckling.
Dock visar varje modell fördelar och begränsningar.
Den heterotopisk luftrör transplantation är enkel att utföra och kräver inga speciella kirurgisk utbildning (3, 5). Efter heterotopisk transplantation kommer luminala utplåning inträffa snabb och fullständig luftvägarna ocklusion visas efter 28 dagar (3, 4, 6). Djur är inte fysiskt påverkas av OAD utveckling, eftersom deras organism inte beror på heterotopisk transplanterade luftstrupen.
En nackdel är bristen på ventilation av transplanterade luftstrupen (7, 6), därför är det inte möjligt att bedöma inverkan av inhalerade patogener (3, 7). På grund av hämning av mucociliary clearance och behållit sekret resultaten kan skilja sig från fysiologiska reaktioner observerats i kliniska OAD (7). Den peritoneal mikromiljö skiljer sig från bröst-miljö vilket också kan leda till förändrade resultat (3).
För att utföra orthotopic trakeal transplantation kirurgisk utbildning är nödvändig och luminala utplåning av de transplanterade luftstrupen visas efter 60 dagar istället för 28 dagar i heterotopisk-modellen (3, 7). Dessutom är maximal luminala utplåning uppnås ca. 45% i stället för 100% i heterotopisk-modellen (3, 7). Men i orthotopic modellen fysiologiska ventilation erhålls och andas in läkemedlet administrering är möjlig (3). Immunologiska svaret, såsom alloreactive IgM-antikroppar har visat sig vara mycket starkare i denna modell än den heterotopisk-modellen (3). Den luftrör-trakeal anastomos och reaktionerna på denna sajt är mer jämförbara med anastomos utförs på kliniken (7).
Fördelar och begränsningar av varje modell visas i detalj i tabell 1.
Sammanfattningsvis visar denna video som både kan heterotopisk liksom orthotopic trakeal transplantation teknik i möss kan användas som reproducerbara och tillförlitliga modeller för att studera OAD.
Dock bör den modell väljas med omsorg beroende på den grundläggande frågan i studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sonja Schrepfer har fått ett forskningsanslag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-1).]
Alla djur fick mänskliga vård i enlighet med principerna för försöksdjursvetenskap Care har djurförsök som utförs i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av National Society for Medicinsk forskning och vägledningen för vård och användning av försöksdjur publiceras av National Institutes of Health (National Institutes of Health publicering 85-23, reviderad 1985).
Alla djur har erhållits från Charles River Laboratories (Sulzfeld, Tyskland) och bibehölls i lokalerna djurvård på Universitetssjukhuset Hamburg Eppendorf. Djuren fick standard chow och vatten ad libitum.
Acknowledgments
Författarna tackar Christiane Pahrmann (Lab Manager).
References
- Adams, B., Berry, G., Huang, X., Shorthouse, R., Brazelton, T., Morris, R. Immunosuppressive therapies for the prevention and treatment of obliterative airway disease in heterotopic rat trachea allografts. Transplantation. 69, 2260-2266 Forthcoming.
- Adams, B., Brazelton, T., Berry, G., Morris, R. The role of respiratory epithelium in a rat model of obliterative airway disease. Transplantation. 69, 661-665 Forthcoming.
- Deuse, T., Schrepfer, S., Reichenspurner, H., Hoyt, G., Fischbein, M., Robbins, R., Pelletier, M. Techniques for experimental heterotopic and orthotopic tracheal transplantations – when to use which model; Transplant Immunology 17. , 255-261 (2007).
- Hele, D., Yacoub, M., Belvisi, M. The heterotopic tracheal allograft as an animal model of obliterative bronchiolitis. Respiratory Research. 2, 169-183 Forthcoming.
- Hertz, M., Jessurun, J., King, M., Savic, S., Murray, J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American Journal of Pathology. 142, (1993).
- McDyer, J. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proceedings of the American Thoracic Society. 4, 37-43 Forthcoming.
- Schrepfer, S., Deuse, T., Hoyt, G., Sheikh, A., Hoffmann, J., Reichenspurner, H., Robbins, R., Pelletier, M. Experimental orthotopic tracheal transplantation: the stanford technique. Microsurgery. 27, 187-189 (2007).
