Summary
इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे एक तेजी से और विश्वसनीय मॉडल का उपयोग करने के लिए myocardial ischemia के pathobiological और pathophysiological प्रक्रियाओं का अध्ययन.
Abstract
Infarction और myocardial ischemia के अनुसंधान मॉडल myocardial ischemia में तीव्र और जीर्ण pathobiological और pathophysiological प्रक्रियाओं की जांच करने और विकसित करने और भविष्य के इलाज का अनुकूलन के लिए आवश्यक हैं.
Myocardial ischemia बनाने के दो अलग अलग तरीकों प्रयोगशाला में rodents प्रदर्शन कर रहे हैं. पहली विधि के लिए क्रायो रोधगलन, एक तेजी से, लेकिन गलत तकनीक, जहां एक क्रायो - कलम दिल की सतह (1-3) पर लागू किया जाता है बना है. इस पद्धति का उपयोग करके वैज्ञानिक गारंटी नहीं दे सकते कि क्रायो निशान ischemia की ओर जाता है है, यह भी एक विशाल दौरे चोट बनाया है कि pathophysiological पक्ष प्रभाव है कि रोधगलन से संबंधित नहीं हैं से पता चलता है. दूसरी विधि बाएँ पूर्वकाल अवरोही धमनी (लाड) की स्थायी ligation है. यहाँ लाड एक ही सिलाई के साथ ligated है, एक ischemia है कि लगभग तुरंत देखा जा सकता है बनाने. लाड बंद करके, उस क्षेत्र में आगे कोई रक्त के प्रवाह की अनुमति है, जबकि आसपास के दौरे ऊतक लगभग प्रभावित नहीं है. यह शल्य प्रक्रिया pathobiological और pathophysiological रोधगलन से संबंधित myocardial ischemia में होने वाली पहलुओं को लुभाती है.
इस वीडियो में शुरू की विधि लाड ligating द्वारा एक माउस रोधगलन मॉडल की शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया को दर्शाता है. इस मॉडल हृदय रोधगलन पर pathobiological और pathophysiological के रूप में के रूप में अच्छी तरह से immunobiological अध्ययन के लिए सुविधाजनक है. दिखाया तकनीक उच्च सटीकता प्रदान करता है और histological वर्गों के साथ अच्छी तरह से संबद्ध है.
Protocol
Balb / सी 8 से 12 सप्ताह की उम्र में 20g की एक न्यूनतम वजन चूहों चार्ल्स नदी (Sandhofer Weg 7, डी - Sulzfeld 97,633) से खरीदे जाते हैं.
चूहे पारंपरिक शर्तों, खिलाया मानक माउस छर्रों और पानी विज्ञापन libitum के तहत रखे जाते हैं . (2%) isoflurane एक प्रेरण कक्ष का उपयोग के साथ माउस anesthetize.
- गर्दन क्षेत्र और ribcage के बाईं ओर दाढ़ी और 80% इथेनॉल का उपयोग कीटाणुरहित.
- अपनी पीठ पर माउस प्लेस और अपनी नाक और मुँह पर एक facemask जगह संज्ञाहरण रखने.
- पूंछ और पिछले पैर pinching लगता है कि माउस पर्याप्त anesthesized है सजगता की जाँच करें.
- सूक्ष्म दृश्य के तहत एक गर्भाशय ग्रीवा के midline त्वचा, मांसपेशियों और ऊतकों ट्रेकिआ कवर अलग चीरा प्रदर्शन.
- जब ट्रेकिआ उजागर उपजिह्वा नीचे दो कारतूस के छल्ले के बीच एक ऊतक में एक छोटा सा छेद अंतःश्वासनलीय ट्यूब (चित्रा 1) सम्मिलित कटौती. अंतःश्वासनलीय ट्यूब पकड़े सूक्ष्म शल्य चिकित्सा forecepts का उपयोग ट्रेकिआ के कपाल भाग सम्मिलित करना. वक्ष आंदोलन की जाँच के लिए यकीन है कि दोनों फेफड़ों अच्छी तरह हवादार हो.
- श्वसन की दर (आरआर) लगभग 110 प्रति मिनट 17 से 18cm एच 2 ओ के inspiratory दबाव के साथ किया जाना चाहिए माउस सावधानी मुड़ें, अपनी सही पक्ष पर झूठ बोल रही है, अपनी बाईं ओर का सामना करना पड़ रहा है. 3 Rd और 4 वें रिब के बीच एक leftsided thoracotomy प्रदर्शन, और ऊतकों और मांसपेशियों को ध्यान से काटना, एक cauter का उपयोग रक्तस्राव को रोकने के.
- छाती सावधानी से खोलें, एक बार छाती खोली जाती है, किसी भी तेज वस्तु के साथ फेफड़ों को छू के बिना दिल मिल जाए,. अब pericardial थैली है कि दिल को कवर है का हिस्सा हटा दें.
- लाड फुफ्फुसीय धमनी और बाएँ कर्ण - शष्कुल्ली के बीच स्थित है. एक 8-0 Prolene सीवन (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) का प्रयोग एक ही सिवनी (चित्रा 2) के साथ प्रॉक्सिमल लाड ligate.
- एक छाती (28G, ज़रख़ीद कैथेटर) ट्यूब, 4 वीं और 5 वीं रिब के बीच रखें .
- परतों में वक्ष चीरा को बंद करें, 6-0 Prolene चल sutures (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) का उपयोग कर पसलियों और 4-0 Prolene चल sutures (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) के अनुकूलन के लिए त्वचा बंद.
- 2ml सिरिंज सावधानी से (चित्रा 3) की मदद के साथ छाती नाली. अपनी पीठ पर माउस रखें. अब अंतःश्वासनलीय ट्यूब बाहर ले और एक ही 7-0 Prolene sutures (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) का उपयोग कर सिलाई के साथ tracheal कारतूस छल्ले अनुकूल है.
- माउस पर चेहरे नकाब प्लेस और त्वचा 4-0 Prolene sutures (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) चलाने का उपयोग बंद.
मान्यकरण
लाड - ligation की सफलता की पुष्टि वहाँ अलग अलग संभावनाएं हैं.
troponin परीक्षण सर्जरी के बाद 6 से 18 घंटे के प्रदर्शन कर सकते हैं, जानवर euthanize करने के लिए आवश्यकता के बिना केवल 150 एल रक्त का उपयोग. रक्त एक स्वनिर्धारित troponin परीक्षण किट (trop संवेदनशील, Roche टी, मैनहेम) (चित्रा 4) के लिए लागू किया जाता है. Troponin मांसपेशी कोशिका के actin filaments में एक क्रम में रखनेवाला प्रोटीन होता है, वहाँ पेशी के तीन प्रकार में विभिन्न isotypes हैं. isotypes cTnI और cTnT दिल में पाए जाते हैं और ऊतक चोट में जारी कर रहे हैं. troponin टी (cTnT) के लिए मानकीकृत परीक्षण दो दिल विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, एक खून का नमूना में troponin जाल पर आधारित है, दूसरा एक एक मार्कर है.
infarcted क्षेत्र में 3 दिन (चित्रा 5) के बाद macroscopically की पहचान कर सकते हैं.
टीटीसी (2,3,5-Triphenyltetrazolium क्लोराइड) धुंधला उपायों ऊतक व्यवहार्यता रोधगलितांश आकार का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया. इवांस नीले रंग में (1,5%, 1.0mL) फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) बाएं निलय गुहा में अंतःक्षिप्त है दौरे इस्कीमिक क्षेत्र को मापने. माउस और euthanized दिल काटा और स्लाइस में sectioned. ऊतकों स्लाइस 1% टीटीसी पीबीएस समाधान, 7.4 पीएच में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20min के लिए incubated रहे हैं. ऊतकों 10% PBS बफर रातोंरात formalin में 2-8 पर तय कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस टीटीसी डाई इवांस नीले नकारात्मक क्षेत्रों (चित्रा 6) के लिए पूर्व vivo दिलाई है.
ऊतक विज्ञान के लिए माउस को euthanized हो गया है और दिल को आगे प्रसंस्करण के लिए एम्बेडेड हो गया है. आयल वर्गों प्रदर्शन करने के बाद, स्लाइड एच एंड ई (hematoxylin और eosin) के साथ दाग रहे हैं या fibrotic ऊतक (चित्रा 7) कल्पना trichrome.
चित्रा 1: Tracheal ट्यूब.
1A: उजागर ट्रेकिआ वेंट्रल ग्रीवा चीरा के बाद.
1B: ट्रेकिआ दो उपास्थि गला करने के लिए दुम छल्ले खोला है.
1C: Tracheal ट्यूब ट्रेकिआ में डाला जाता है.
चित्रा 2: दिल बाईं तरफा thoracotomy के माध्यम से अवगत कराया है, लाड ligated है.
चित्रा 3: छाती के बाद बंद कर दिया है, फुस्फुस का आवरण नाली किया जाता है . माउस संज्ञाहरण के तहत अभी भी है.
चित्रा 4: दो लाइनें कुछ ही मिनटों के बाद दिखाई देते हैं जब troponin परीक्षण सकारात्मक है.
चित्रा 5: explanted दिल दिखाता है.
5A: एक फीका सफेद रंग के साथ ischemic क्षेत्र के साथ दिल की macroscopic दृश्य.
5B: infarcted दिल की क्रॉस अनुभाग, इस्कीमिक क्षेत्र के ऊपरी दाएँ कोने में दिखाता है.
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Discussion
संक्षेप में, इस वीडियो को लाड - ligation मॉडल कदम दर कदम visualizes है और आसानी से संभव शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं के रूप में चूहों में लाड - ligations को पहचानती है.
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Acknowledgments
लेखकों उसे तकनीकी सहायता और प्रदर्शन ऊतक विज्ञान के लिए Christiane Pahrmann धन्यवाद.
References
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- Joung, B., Kim, I. K. Bone marrow mononuclear stem cells transplanted in rat infarct myocardium improved the electrical conduction without evidence of proarrhythmic effects. Yonsei Med J. 48 (5), 754-764 (2007).
