Summary
Deze video laat zien hoe u een snelle en betrouwbare model te gebruiken om pathobiological en pathofysiologische processen van myocardischemie te bestuderen.
Abstract
Onderzoek modellen van infarct en myocardiale ischemie zijn essentieel voor de acute en chronische pathobiological en pathofysiologische processen te onderzoeken in myocardiale ischemie en het ontwikkelen en optimaliseren van toekomstige behandeling.
Twee verschillende methoden van het creëren van myocardischemie worden uitgevoerd in het laboratorium knaagdieren. De eerste methode is het creëren van cryo infarct, een snelle maar onjuist techniek, waarbij een cryo-pen wordt aangebracht op het oppervlak van het hart (1-3). Met behulp van deze methode wordt de wetenschapper kan niet garanderen dat de cryo-litteken leidt tot ischemie, ook een groot myocard letsel is ontstaan dat laat zien pathofysiologische bijwerkingen die niet gerelateerd zijn aan een hartinfarct. De tweede methode is de permanente ligatie van de linker anterior descending arterie (LAD). Hier is de LAD wordt geligeerd met een enkele steek, de vorming van een ischemie dat kan vrijwel direct te zien. Door het sluiten van de LAD, is geen verdere bloedstroom toegestaan in dat gebied, terwijl de omliggende myocard weefsel is bijna niet beïnvloed. Deze chirurgische procedure imiteert de pathobiological en pathofysiologische aspecten die voorkomen in infarct-gerelateerde myocardischemie.
De methode die in deze video demonstreert de chirurgische procedure van een muis infarct model door het ligeren van de LAD. Dit model is handig voor pathobiological en pathofysiologische evenals immunobiologische studies over hart-infarct. De getoonde techniek biedt een hoge nauwkeurigheid en correleert goed met histologische secties.
Protocol
Balb / C-muizen met een gewicht van minimaal 20g op een leeftijd van 8 tot 12 weken worden gekocht van Charles River (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld).
Muizen zijn gehuisvest onder gangbare condities, gevoed standaard muis pellets en water ad libitum. Verdoven muis met isofluraan (2%) met behulp van een inductie kamer.
- Scheer de nek en de linker zijkant van de ribbenkast en desinfecteren met 80% ethanol.
- Plaats de muis op zijn rug en zet een masker over zijn neus en mond te houden van de anesthesie.
- Controleer de reflexen knijpen de staart en achterpoten voeten om er zeker van dat de muis is voldoende anesthesized.
- Onder microscopisch zicht het uitvoeren van een middellijn cervicale incisie het scheiden van de huid, spieren en weefsel die de luchtpijp.
- Wanneer de luchtpijp wordt blootgesteld gesneden een klein gaatje in het weefsel tussen twee cartridge ringen onder de glottis naar de endotracheale tube (figuur 1) in te voegen. Plaats de endotracheale tube die de craniale deel van de luchtpijp met behulp van micro-chirurgische forecepts. Controleer de thoracale beweging om er zeker van dat beide longen goed worden geventileerd.
- De ademhaling (RR) zou ongeveer 110 per minuut, met een inspiratoire druk van 17 tot 18cm H 2 O. Draai de muis, liggend op de rechterzijde, met uitzicht op de linkerkant. Voer een leftsided thoracotomie tussen de 3 e en de 4 e rib, en zorgvuldig ontleden het weefsel en spieren, met behulp van een Cauter om het bloeden te voorkomen.
- Voorzichtig open de thorax, zodra de thorax is geopend, vinden het hart, zonder het aanraken van de long met een scherp voorwerp. Verwijder nu het deel van de hartzak dat is voor het hart.
- De LAD is gelegen tussen de longslagader en de linker oorschelp. Gebruik een 8-0 Prolene hechtdraad (Ethicon, Norderstedt, Duitsland) aan de LAD proximale met een enkele hechting (figuur 2) afbinden.
- Plaats een kist buis (28G, omkoopbare katheter), tussen de 4 e en de 5 e rib.
- Sluit de thoracale incisie in lagen, met behulp van 6-0 Prolene lopen hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland) aan de ribben en 4-0 Prolene lopen hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland) aan te passen om de huid te sluiten.
- Afvoer van de thorax met de hulp van een 2 ml injectiespuit voorzichtig (figuur 3). Plaats de muis op zijn rug. Neem nu de endotracheale tube uit en aan te passen de tracheale cartridge ringen met een enkele steek met 7-0 Prolene hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland).
- Plaats het masker op de muis en sluit de huid met 4-0 Prolene lopen hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland).
Validatie
Er zijn verschillende mogelijkheden om het succes van de LAD-ligatie te bevestigen.
De troponine test kan worden uitgevoerd 6 tot 18 uur na de operatie, met behulp van slechts 150 liter bloed zonder de noodzaak om het dier te euthanaseren. Het bloed wordt toegepast op een aangepaste troponine test kit (TROP T Gevoelig, Roche, Mannheim) (figuur 4). Troponine is een regulatief eiwit in de actine filamenten van de spiercel, zijn er verschillende isotypen in de drie soorten spieren. De isotypen cTnI en cTnT zijn te vinden in het hart en zijn uitgebracht in weefselschade. De gestandaardiseerde test voor troponine T (cTnT) is gebaseerd op twee hart van specifieke monoklonale antilichamen, een vallen de troponine in het bloed, de tweede is een marker.
Het infarct gebied kan macroscopisch worden geïdentificeerd na 3 dagen (figuur 5).
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) kleuring maatregelen levensvatbaarheid van het weefsel gebruikt om infarctgrootte te evalueren. Evans blauwe kleurstof (1,5%, 1,0 ml) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) wordt ingespoten in de linker ventrikel holte aan het myocard ischemische gebied te meten. De muis is gedood en het hart is geoogst en coupes in plakjes. Het weefsel plakjes worden geïncubeerd in 1% TTC PBS-oplossing, pH 7,4 bij 37 ° C voor 20min. Weefsels worden gefixeerd in 10% PBS-gebufferde formaline gedurende de nacht bij 2-8 ° C. TTC wordt toegediend ex vivo te verven Evans blue-negatieve gebieden (Figuur 6).
Voor histologie de muis ze worden gedood en het hart moet worden ingesloten voor verdere verwerking. Na het uitvoeren van paraffine secties, dia's gekleurd met H & E (hematoxyline en eosine) of trichroom om fibrotische weefsel (figuur 7) te visualiseren.
Figuur 1: tracheale tube.
1A: Exposed luchtpijp, na het ventrale cervicale incisie.
1B: Luchtpijp is geopend twee kraakbeen ringen caudaal van het strottenhoofd.
1C: Tracheale buis wordt ingebracht in de luchtpijp.
Figuur 2: Het hart is blootgesteld via een linkszijdige thoracotomie, de LAD wordt geligeerd.
Figuur 3: Na de thorax gesloten is, een pleura drain wordt uitgevoerd. De muis is nog steeds onder narcose.
Figuur 4: Twee lijnen verschijnen na een paar minuten wanneer de troponine test positief is.
Figuur 5: Geeft de geëxplanteerd hart.
5A: Macroscopische uitzicht op het hart met de ischemische gebied met een vervaagde witachtige kleur.
5B: Dwarsdoorsnede van het infarct hart, het ischemische gebied shows in de rechter bovenhoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kortom, deze video visualiseert de LAD-ligatie model stap-voor-stap en identificeert LAD-ligaties bij muizen zo gemakkelijk mogelijk chirurgische procedures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Financiering
De huidige studie werd ondersteund door het Universitair Ziekenhuis Hamburg (MK, Woman Habilitation Grant), DFG (SS, SCHR992/3-1), ISHLT (TD, Research Award 2009).
Verklaring
Alle dieren kregen menselijke zorg in overeenstemming met de beginselen van het Laboratory Animal Care, werden experimenten op dieren uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Nationale Vereniging voor Medisch onderzoek en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health (National Institutes of Health publicatie 85-23, herzien 1985).
Alle dieren werden verkregen van Charles River Laboratories (Sulzfeld, Duitsland) en werden gehouden in het dier opvang van het Universitair Ziekenhuis Hamburg Eppendorf. De dieren kregen standaard chow en water ad libitum.
Acknowledgments
De auteurs danken Christiane Pahrmann voor haar technische bijstand en het uitvoeren van histologie.
References
- Atkins, B. Z., Hueman, M. T. Cellular cardiomyoplasty improves diastolic properties of injured Heart. J Surg Res. 85 (2), 234-242 (1999).
- Jaquet, K., KT, K. rause Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells Dev. 14 (3), 299-309 (2005).
- Joung, B., Kim, I. K. Bone marrow mononuclear stem cells transplanted in rat infarct myocardium improved the electrical conduction without evidence of proarrhythmic effects. Yonsei Med J. 48 (5), 754-764 (2007).
