Biology

LAD -ライゲーション：心筋梗塞のマウスモデル

Published: October 14, 2009 doi: 10.3791/1438

Mandy V.V. Kolk^1,2, Danja Meyberg^1,2, Tobias Deuse^1,2, Karis R. Tang-Quan^1,2,3, Robert C. Robbins³, Hermann Reichenspurner^1,2, Sonja Schrepfer^1,2,3

¹Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab (TSI), University Heart Center Hamburg, ²CVRC, University Hospital Hamburg, ³Department of CT Surgery, Stanford University School of Medicine

Summary

このビデオでは、心筋虚血のpathobiologicalと病態生理学的プロセスを研究するために高速で信頼性の高いモデルを使用する方法を示します。

Abstract

心筋梗塞や心筋虚血の研究のモデルは、心筋虚血の急性および慢性のpathobiologicalと病態生理学的プロセスを調査し、将来の治療法の開発と最適化するために不可欠です。

心筋虚血を作成するための二つの異なる方法が実験用げっ歯類で実行されます。最初の方法は、低温ペンが心臓（1-3）の表面に適用されているクライオ心筋梗塞、高速だが不正確なテクニックを、作成することです。科学者は、クライオ傷跡が虚血につながることを保証できない場合、このメソッドを使用して、また広大な心筋障害は、心筋梗塞に関連していない病態生理学的な副作用を示すことが作成されます。第二の方法は、左前下行枝（LAD）の恒久的なライゲーションです。ここでLADはほぼ即座に見ることができる虚血を形成し、単一のステッチと連結する。周囲の心筋組織がほとんど影響されないままLADを閉じることで、それ以上の血流は、その領域で許可されていません。この手術は、心筋梗塞に関連する心筋虚血の発生pathobiologicalと病態生理学的側面を模倣する。

このビデオで紹介した方法では、LADを結紮することにより、マウスの心筋梗塞モデルの外科的手順を示しています。このモデルでは、心筋梗塞でpathobiologicalおよび病態生理学的ならびに免疫生物学的研究のために便利です。示した手法は、高い精度を提供し、組織切片とよく相関している。

Protocol

8から12週齢で20gの最小の重量を量るのBalb / Cマウスをチャールズリバー（Sandhoferウェグ7、D - 97633 Sulzfeld）から購入しています。
マウスは、通常の条件、飼育、標準のマウスのペレットと水を自由の下に収容されています。誘導チャンバーを用いて（2％）イソフルランでマウスを麻酔。

首の領域と胸郭の左側にひげをそると80％エタノールを用いて消毒する。
その背中にマウスを置き、麻酔を維持するために、その鼻と口にフェイスマスクを置く。
マウスが十分anesthesizedであることを確認するために、尾と後ろ足の足をつまんで反射神経をチェックしてください。
微視的な視点の下で気管を覆う皮膚、筋肉や組織を分離する正中頸部切開を行います。
気管は、気管内チューブ（図1）を挿入するには声門下の2つのカートリッジの環の間の組織に小さな穴をカットさらされている場合。マイクロ手術foreceptsを使用して気管の頭蓋の一部を保持する気管内チューブを挿入します。両方の肺がよく換気されていることを確認するために胸部の動きを確認してください。
呼吸速度（RR）は、17〜18センチメートルH _{2 O}の吸気圧で、約110分毎にする必要がありますその左側に面して、その右側に横たわって、慎重にマウスを回す。 ³番目と4 ^番目の肋骨の間にleftsided開胸を行い、出血を防ぐために焼灼器を使用して、慎重に組織や筋肉を細かく分析。
胸部が開かれると、慎重に胸部を開き、任意のとがったもので肺に触れることなく、心を見つける。今の心を覆っている心膜の一部を削除してください。
LADは、肺動脈と左心耳の間に位置しています。一つの縫合（図2）と近位LADを連結する8から0 Proleneの縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用してください。
4 ^番目と5 ^番目のリブの間に胸腔チューブを（28G、腐敗したカテーテル）、置きます。
肋骨と皮膚を閉じるには、縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を実行して4から0 Proleneを適応させるために6から0 Prolene実行されている縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用して、レイヤーの胸部切開を閉じます。
慎重に2ミリリットル注射器（図3）の助けを借りて胸部を排出します。その背中にマウスを置きます。今すぐ気管内チューブを取り出して、7から0 Prolene縫合を（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）使用して、1つのシングルステッチで気管カートリッジのリングを適応させる。
マウスの顔のマスクを置き、4から0 Prolene実行されている縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用して皮膚を閉じます。

検証

LAD -ライゲーションの成功を確認するために、異なる可能性があります。

トロポニンテストは、動物を安楽死させることなく、唯一の150リットルの血液を使用して、手術後6時間から18時間を行うことができます。血液は、カスタマイズされたトロポニンテストキット（過度にTセンシティブ、ロシュ、マンハイム）（図4）に適用されます。トロポニンが筋細胞のアクチンフィラメントの調節的蛋白質である、筋肉の3つのタイプの異なるアイソタイプがあります。アイソタイプcTnIとcTnTを中心に発見され、組織損傷にリリースされます。トロポニンT（cTnT）のための標準化されたテストは、2つの心臓特異的モノクローナル抗体を、一つのトラップ血液試料中のトロポニンに基づいている、もう一つはマーカーです。

梗塞部位は、3日間（図5）の後に肉眼的に識別できます。

TTC（2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム）染色対策組織の生存率は梗塞サイズを評価するために使用。エバンスブルー色素（1,5％、1.0mL）中のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）は心筋の虚血領域を測定するために左室内腔に注入される。マウスを安楽死であり、心臓はスライスに採取し、切片化されています。組織切片は20分、37 ° Cで1％TTC PBS溶液、pH7.4でインキュベートする。組織は2〜8℃で一晩PBS -バッファ、10％ホルマリンで固定されている℃のTTCは、色素エバンスブルー陰性の領域（図6）にex vivoで投与される。

組織学のためにマウスは安楽死されなければならないと心はさらなる処理のために埋め込まれなければなりません。パラフィン切片を実行した後、スライドはH＆E（ヘマトキシリンとエオジン）で染色または線維性組織（図7）を可視化するために三色のされています。

図1：気管チューブ。
1A：気管を露出、腹側頸部切開後。
1B：気管は喉頭に尾two軟骨リングを開かれます。
1C：気管チューブを気管に挿入されます。