LAD-Ligation: en mus modell av hjärtinfarkt

Summary

Denna video visar hur man använder en snabb och pålitlig modell för att studera pathobiological och patofysiologiska processer av ischemi.

Abstract

Forskning modeller för infarkt och ischemi är nödvändiga för att undersöka akut och kronisk pathobiological och patofysiologiska processer i myokardischemi och att utveckla och optimera framtida behandling.

Två olika metoder för att skapa ischemi utförs på smågnagare. Den första metoden är att skapa Cryo infarkt, en snabb men felaktiga teknik, där en kryo-penna appliceras på ytan av hjärtat (1-3). Med den här metoden forskaren inte kan garantera att Cryo-ärr leder till ischemi, också en stor myokardskada skapas som visar patofysiologiska biverkningar som inte är relaterade till hjärtinfarkt. Den andra metoden är den permanenta ligation i vänster främre nedstigande artären (LAD). Här LAD är knyts ihop med en enda söm, bildar en ischemi som kan ses nästan omedelbart. Genom att stänga LAD, behövs ingen ytterligare blodflödet tillåtet i det området, medan den omgivande hjärtinfarkt vävnaden är nästan inte påverkas. Detta kirurgiska ingrepp imiterar pathobiological och patofysiologiska aspekter som förekommer i infarkt-relaterade myokardischemi.

Metoden introducerades i den här videon visar kirurgiskt ingrepp som en mus infarkt modell genom underbindning av LAD. Denna modell är bekvämt för pathobiological och patofysiologiska samt immunbiologiska studier på hjärtinfarkt. De visade Tekniken ger hög noggrannhet och korrelerar väl med histologiska sektioner.

Protocol

BALB / c möss som väger minst 20 g vid en ålder av 8 till 12 veckor köps från Charles River (Sandhofer Weg 7, D-97.633 Sulzfeld).
Möss är inhysta i vanliga förhållanden, matas standard pellets mus och vatten ad libitum. Bedöva mus med isofluran (2%) med hjälp av en induktion kammare.

1. Raka nacken och den vänstra sidan av bröstkorgen och desinficera med 80% etanol.
2. Placera musen på rygg och lägg en ansiktsmask över dess näsa och mun för att hålla uppe anestesi.
3. Kontrollera reflexer nypa svansen och bakfötterna vara säker på att musen är tillräckligt anesthesized.
4. Enligt mikroskopisk tanke utföra en mittlinje livmoderhalscancer snitt separera hud, muskler och vävnad som täcker luftstrupen.
5. När luftstrupen utsätts skära ett litet hål i vävnaden mellan två patron ringar under glottis att infoga endotrakealtub (Figur 1). Sätt i endotrakealtub håller kraniella delen av luftstrupen med en mikro kirurgiska forecepts. Kontrollera bröstkorg rörelsen vara säker på att båda lungorna är väl ventilerade.
6. Den andningsfrekvens (RR) bör vara ca 110 per minut, med en inspiratorisk tryck på 17 till 18 cm H ₂ O. Vänd musen försiktigt, liggande på höger sida, vänd dess vänstra sida. Gör en leftsided torakotomi mellan den 3: ^e och ^{4: e} revbenet, och dissekera vävnader och muskler försiktigt, med hjälp av en cauter att förhindra blödning.
7. Öppna bröstkorgen försiktigt, när bröstkorgen öppnas, hitta hjärtat, utan att röra vid lungan med något vasst föremål. Nu tar bort den del av hjärtsäcken som täcker hjärtat.
8. Pojken ligger mellan lungartären och vänster hjärtörat. Använd en 8-0 Prolene suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland) för att ligate the Lad proximala med en enda sutur (Figur 2).
9. Placera en kista rör (28G, korrumperad kateter), mellan den 4: ^e och ^{5: e} revbenet.
10. Stäng bröstkorg snitt i lager, med 6-0 Prolene kör suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland) för att anpassa revben och 4-0 Prolene kör suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland) för att stänga huden.
11. Tappa bröstkorgen med hjälp av en 2 ml spruta försiktigt (Figur 3). Placera musen på rygg. Ta nu endotrakealtub ut och anpassa luftstrupen patronen ringar med ett enda stygn med 7-0 Prolene suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland).
12. Placera ansiktsmask på musen och stäng huden med 4-0 Prolene kör suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland).

Validering

Det finns olika möjligheter för att bekräfta framgången med LAD-ligatur.

Den troponin Testet kan utföras 6 till 18 timmar efter operationen, med enbart 150 l blod utan att avliva djuret. Blodet appliceras på en anpassad troponin testkit (TROP T Känslig, Roche, Mannheim) (Figur 4). Troponin är ett reglerande protein i aktin filament i muskelcellerna, det finns olika isotyper i tre typer av muskler. Den isotyper cTnI och cTnT finns i hjärtat och släpps i vävnad skada. Den standardiserade test för troponin T (cTnT) bygger på två centrala specifika monoklonala antikroppar, en fällor de troponin i blodprovet, är den andra en markör.

Det infarktområdet kan identifieras makroskopiskt efter 3 dagar (Figur 5).

TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium klorid) färgning åtgärder vävnad livskraft används för att utvärdera infarkt storlek. Evans blått färgämne (1,5%, 1,0 ml) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) sprutas in i vänster kammare hålrum för att mäta myokardischemi området. Musen är euthanized och hjärtat skördas och snittades i skivor. Vävnaden skivor inkuberas i 1% TTC PBS, pH 7,4 vid 37 ° C i 20min. Vävnader är fasta i 10% PBS-buffrad formalin natten vid 2-8 ° C. TTC administreras ex vivo för att färga Evans Blue-negativa områden (Figur 6).

För histologi musen måste avlivas och hjärtat måste ingå för vidare bearbetning. Efter att ha utfört paraffin, är bilderna färgas med H & E (hematoxylin och eosin) eller trikrom att visualisera fibrotiska vävnad (Figur 7).

Figur 1: trakealtub.
1A: Exposed luftstrupe, efter ventrala livmoderhalscancer snitt.
1B: Luftstrupe öppnas två brosk ringar caudal till struphuvudet.
1C: trakealtub sätts in i luftstrupen.

Figur 2: Hjärtat är exponerad genom en vänstersidig torakotomi är LAD knyts ihop.

t ">
Figur 3: Efter att bröstkorgen är stängt, är en lungsäcken avlopp utförs. Musen är fortfarande under narkos.

Figur 4: Två linjer framträder efter några minuter när troponin testet är positivt.

Figur 5: Visar explanterade hjärtat.
5A: Makroskopisk bild av hjärtat med ischemiska området med en blek vitaktig färg.
5B: Tvärsnitt av infarktzonen hjärtat, visar det ischemiska området i övre högra hörnet.

Discussion

Sammanfattningsvis visualiserar denna video the Lad-ligation modell steg-för-steg och identifierar LAD-ligations i möss som lätt genomförbar kirurgiska ingrepp.