Summary
Ein Zelltod-basierter Assay für PTI in Nicotiana benthamiana Pflanzen beschrieben.
Abstract
Um wahrnehmen potenzielle Krankheitserreger in ihrer Umwelt, verwenden Pflanzen pattern recognition receptors (PRR), die auf ihrer Plasmamembran. PRRs erkennen konservierte mikrobielle Eigenschaften genannt pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und diese Erkennung führt zu PAMP ausgelöste Immunität (PTI), das verhindert, Kolonisierung Pflanzengewebe durch Nicht-Erreger 1,2. Die gut untersuchte System in PTI ist die FLS2-abhängige Pfad 3. FLS2 erkennt die PAMP flg22, dass eine Komponente des bakteriellen Flagellin ist.
Erfolgreiche Krankheitserreger besitzen Virulenzfaktoren oder Effektoren, die PTI unterdrücken und damit die Erreger Krankheit 1 führen kann. Einige Pflanzen wiederum besitzen Resistenzgene, die Effektoren oder ihre Tätigkeit, die Effektor-triggered Immunität (ETI) 2 führt zu erkennen.
Wir beschreiben ein Zelltod-basierter Assay für PTI von Oh und Collmer 4 modifiziert. Der Assay wurde standardisiert in N. benthamiana, die verwendet wird zunehmend als ein Modellsystem für die Untersuchung von Pflanzen-Pathogen Interaktionen 5. PTI ist durch Infiltration eines nicht-pathogenen Bakterienstamm in den Blättern. Sieben Stunden später, ein Bakterienstamm, der entweder krank macht oder welche aktiviert ETI in einen Bereich ohne Zwischenraum über die ursprüngliche Infiltration Zone infiltriert. PTI vom ersten Infiltration induziert der Lage ist, verzögern oder verhindern das Auftreten von Zelltod durch die zweite Herausforderung Infiltration. Umgekehrt zeigt das Aussehen des Zelltods in den überlappenden Bereich der Impfung eine Aufschlüsselung der PTI.
Vier verschiedene Kombinationen von Induktoren von PTI und Herausforderung Impfungen wurden standardisiert (Tabelle 1). Der Test wurde auf Nicht-Schweigen N. getestet benthamiana Pflanzen, wie die Kontrolle und Anlagen für FLS2 zum Schweigen, die voraussichtlich in ihrer Fähigkeit, PTI entwickeln beeinträchtigt werden serviert wurden.
Protocol
Teil 1: Pflanzenwachstum und Wartung
Nicotiana benthamiana Pflanzen im Assay verwendet werden sollte ca. 7 Wochen alt. Sie sollten getrimmt mindestens 4-5 Tage vor dem Test werden alle axillären Zweige und Blüten entfernen. Es ist eine gute Idee, axilläre Zweige bald entfernen, nachdem sie entstehen, damit die Pflanzen mehr überschaubar.
Teil 2: Bakterienkultur
TAG 1:
- Platten oder Kulturen für alle Stämme im Assay verwendet werden zur gleichen Zeit gestartet. Für die Pseudomonas spp. die sind 2-Induktoren und 3 Herausforderung Stämme, Streifen Bakterien auf KBM-Platten mit den entsprechenden Antibiotika aus gefrorenen Glycerin Aktien (Tabelle 2). Eine kleine Menge von Bakterien sollte auf der Mitte der Platte verteilt werden. Die Platte bei 30 ° C für ca. 18-24 Stunden. Für Agrobacterium, starten Sie eine flüssige Kultur in 2 ml LB aus einer frischen Platte und wachsen über Nacht bei 250 rpm, 30 ° C.
TAG 2:
- Für Pseudomonas, fügen 150-200 ul Flüssigkeit KBM, um die Bakterien und breitete sie über die gesamte Platte mit einem sterilen Glas-Spreader. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator und lassen Sie es für ein anderes 20-24 Stunden wachsen. Es sollte ein Bakterienrasen auf der Platte am nächsten Tag unter Angabe gutes Wachstum. Für Agrobacterium, starten Sie eine zweite Kultur in ca. 5-10 ml LB mit 20 uM Acetosyringon und wachsen lassen über Nacht auf 20 Stunden bei 250 rpm, 30 ° C.
Teil 3: Herstellung von Pflanzen für den Test
TAG 2:
- Einen Tag vor dem Test sollten die Pflanzen in einen Raum bei 22-24 ° C bewegt, ~ 35-40% relativer Luftfeuchtigkeit und konstantem Licht.
- Mark Kreise auf den Blättern, die mindestens 1,5 cm im Durchmesser mit einem dicken, schwarzen Marker. Zwei bis vier Kreise können pro Blatt gekennzeichnet werden. Die Kreise sollten gut verteilt und bevorzugt nicht über eine große Vene. Wählen Sie gut entwickelte Blätter. Vermeiden älteren Blättern oder Blätter, die harte oder dicke im Griff und vermeiden Kennzeichnung Kreise auf den unteren Abschnitten des Blattes.
Kennzeichnung Kreisen einen Tag vor dem Experiment ist nicht unbedingt erforderlich, um das Protokoll. Allerdings spart Zeit, wenn es eine große Anzahl von Pflanzen, die getestet wird, und macht es einfacher, präzises Timing zwischen der Induktion von PTI und Herausforderung Impfungen zu erreichen.
Teil 4: Induktion von PTI
TAG 3:
- Ernten Sie die Zellen von der Platte in 10 mM MgCl 2 für P. fluorescens und P. putida. Für Agrobacterium, Zentrifuge der Kultur, um Zellen zu sammeln und resuspendieren in 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Resuspendieren in der MgCl 2-MES-Lösung. Die optische Dichte (OD) der Zellen bei 600 nM. Passen Sie die ODS die endgültige geforderten Werte wie in Tabelle 2 beschrieben. In der MgCl Pseudomonas schließlich sollte in 10 mM MgCl 2 und Agrobacterium resuspendiert 2-MES-Lösung. Ein Gesamtvolumen von 25 ml ist ausreichend, um etwa 40-50 Punkte zu impfen.
- Infiltrate der PTI-Induktoren in die vorgezeichneten Kreise auf den Blättern mit einer 1 ml Spritze ohne Nadel. Notieren Sie sich die Reihenfolge, in der die Pflanzen eingeschleust und die genaue Zeit, als die Infiltration begonnen wurde.
Teil 5: Challenge Impfung
- Bereiten P. syringae pv.. Tomaten DC3000, DC3000 Pst Δ hopQ1-1 und Ps pv. tabaci für die Herausforderung, wie in Teil 4.1 und Tabelle 2 beschrieben.
- Sieben Stunden nach dem Induktor Infiltration, führen Sie die Herausforderung Infiltration in der gleichen Reihenfolge von Pflanzen wie die Induktion wurde. Im Allgemeinen kann ein Punkt auf der Peripherie der ersten Impfung Kreis als Mitte der zweiten Impfung Kreis eingesetzt werden. Wenn es mehrere Punkte auf ein Blatt werden dann sicherstellen, dass die Infiltrationen nicht überschneiden.
- Platte Verdünnungsreihen aller Kulturen in den Assay auf KBM oder LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika verwendet werden, um die genaue CFU Zahl zu bestimmen.
Teil 6: Scoring für den Abbau von PTI
Tag 5:
- Achten Sie auf das Auftreten von Zelltod durch ETI in den Spots, die mit Pst DC3000 herausgefordert wurden. Der Zelltod im überlappenden Bereich der Infiltration zeigt eine Aufschlüsselung der PTI und sollte als positive Phänotyp erzielt werden.
Tag 7:
- Achten Sie auf das Auftreten von Zelltod durch Krankheit in den Flecken, die mit Pst DC3000 Δ hopQ1-1 oder Ps pv in Frage gestellt wurden. Tabaci
Wenn die Kontroll-Pflanzen (das sollte nicht für PTI beeinträchtigt werden), um den Zelltod in den überlappenden Bereich der Infiltration zeigen beginnen, aufhören, weitere Beobachtungen.
Teil 7: Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt das Ergebnis eines Tests, wenn P. fluorescens wurde als Induktor und Pst DC3000 als Herausforderung genutzt.
Abbildung 1. P. fluorescens wurde auf N. infiltriert benthamiana Blätter (schwarzer Kreis) zu induzieren PTI und 7 Stunden später, vor Ort wurde mit Pst DC3000 (weißer Kreis) in Frage gestellt. Pflanzen für FLS2 Schweigen zeigte eine Aufschlüsselung der PTI in der Region, wo P. fluorescens wurde infiltriert (A), geändert durch Zelltod zu sehen. Control-Anlagen, die nicht zum Schweigen gebracht wurden, zeigten keine Zelltod in dem überlappenden Bereich aufgrund der Induktion von PTI (B). Rote Pfeile zeigen Mangel an oder das Vorhandensein von Zelltod in dem überlappenden Bereich der Infiltration. Fotos wurden 2 Tage nach der Infiltration genommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.
| PTI-Induktor | Zelltod-auslösenden Herausforderung | Natur des Zelltods | Code |
| Pseudomonas fluorescens 55 | Pseudomonas syringae pv tomato (Pst.) DC3000 6 | ETI | Pf / DC |
| P. putida KT2440 | Pst DC3000 | ETI | Pp / DC |
| P. fluorescens 55 | Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 | Krankheit | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | P. syringae pv.. tabaci 11528R | Krankheit | Agro / PTAB |
Tabelle 1: Kombinationen von PTI induzieren und Zelltod-auslösenden Mikroben in den Zelltod Assay für PTI verwendet.
| Bakterienstamm | Selektionsmedium | Finale OD verwendet im Experiment | Entsprechende CFU / ml |
| P. fluorescens 55 | KBM Ampicillin (100 ug / ml) | 0,5 | 1 x 10 9 |
| P. putida KT2440 | KBM Ampicillin (100 ug / ml) | 0,5 | 1 x 10 8 |
| A. tumefaciens GV2260 | LB Rifampicin (100 ug / ml) | 0,5 | 5 x 10 8 |
| Pst DC3000 | KBM Rifampicin (100 ug / ml) | 0,02 | 2 x 10 7 |
| Pst DC3000 Δ hopQ1-1 | KBM Rifampicin (100 ug / ml) | 100-fache Verdünnung von 0,1 | 1 x 10 6 |
| P. syringae pv.. tabaci 11528R | KBM Rifampicin (100 ug / ml) | 100-fache Verdünnung von 0,1 | 1 x 10 6 |
Tabelle 2: Culture Bedingungen und Inokulum Ebenen in den Test eingesetzt. Die OD und die entsprechenden CFU Werte können zwischen verschiedenen Marken von Spektralphotometern variieren.
Discussion
Das Zelltod-basierte Test kann verwendet werden, um die Beteiligung eines Gens in PTI bestimmen. Zum Beispiel kann loss-of-function-Mutanten für ein Gen von Interesse unter Verwendung dieses Tests sein. Von den 4 Kombinationen von Induktor und Herausforderung Impfungen in Tabelle 1 angegeben, ist es möglich, dass nur eine Kombination kann in einem Phänotyp in Ihrer Anlage Hintergrund führen. Wir haben beobachtet, dass Pflanzen für FLS2 Schweigen eine Aufschlüsselung der PTI in der Pf / DC und Pf/Q1-1 Kombinationen von Induktor und Herausforderung Impfungen (Tabelle 1) zeigen.
Es ist wichtig, dass die ökologischen Bedingungen für die Tests sind so nah wie möglich an die in Teil 3.1 beschrieben. Zu trockene Luft führt zum Zelltod, zu schnell zu fahren, so dass der Test nur schwer zu punkten. Wenn die Bedingungen in unserem Protokoll beschrieben werden, nicht in Ihrem Labor funktionieren, dann versuchen Sie die Änderung der Höhe der Induktor oder Herausforderung Impfung. Ein weiterer Parameter, die geändert werden können, ist die zeitliche Lücke zwischen Induktion und der Provokation, obwohl wir festgestellt, dass kürzere Zeitabstände der Test zu brechen zu schnell unter Kontrolle Pflanzen verursacht haben.
Wir empfehlen, dass mindestens 4-5 Pflanzen in einem Experiment getestet werden und eine positive Phänotyp sollte mindestens 3-4 unabhängigen Experimenten wiederholt werden.
Acknowledgments
Wir danken Hye-Sook Oh, Joanne Morello und Alan Collmer, Department of Plant Pathology und Pflanzen-Mikroben-Biologie, Cornell University, für wertvolle Diskussionen. Wir danken Jesse Munkvold für Kommentare zu diesem Artikel. Die Finanzierung wurde von der National Science Foundation Pflanzengenom-Programm bereitgestellt, Vergabe-Nummer DBI-0605059 (GBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
