Summary
タバコbenthamiana植物のPTIのための細胞死ベースのアッセイが記載されている。
Abstract
自分の環境で潜在的な病原体を認識するために、植物はそれらの形質膜上に存在するパターン認識受容体（PRRS）を使用してください。 PRRSは、病原体関連分子パターン（PAMPs）と呼ばれる保存された微生物の機能を認識し、この検出には効果的に非病原体の1,2により、植物組織の植民地化を防ぐPAMPトリガ免疫（PTI）、につながる。 PTIで最もよく研究システムは、FLS2依存性経路3です。 FLS2は、細菌のフラジェリンのコンポーネントであるPAMP flg22を認識します。
成功した病原体は病原性因子またはPTIを抑制し、病原体が病気1を引き起こすことができることができるエフェクターを持っている。順番にいくつかの植物は、エフェクターやエフェクタートリガ免疫（ETI）2につながる彼らの活動を、検出抵抗性遺伝子を持っている。
私たちは、ああ、Collmer 4から変更されたPTIのための細胞死ベースのアッセイを説明します。アッセイは、Nで規格化されました植物-病原体相互作用5の研究のためのモデル系としてますます使用されているbenthamiana、。 PTIは、葉への非病原性菌株の浸透によって誘導される。七時間後、どちらかの病気を引き起こすか、ETIを活性化する菌株は、オリジナルの浸透ゾーンをオーバーラップ領域に浸透しています。第一浸潤により誘導されたPTIは、第二の課題の浸潤に起因する細胞死の外観を遅らせたり、防止することができます。逆に、接種のオーバーラップ領域における細胞死の外観は、PTIの内訳を示している。
PTIとチャレンジ接種の誘導の4種類の組み合わせは、（表1）標準化した。アッセイは非サイレンシングNでテストされていますPTIを開発する能力が損なわれると予測されたFLS2のために沈黙の制御と植物を務めたbenthamiana植物 。
Protocol
パート1：植物の成長と維持
アッセイで使用されているタバコbenthamiana植物は、約7週齢にする必要があります。彼らはすべての腋窩枝や花を削除するには少なくとも4-5日間アッセイの前にトリミングする必要があります。それは植物がより管理しやすくするために、すぐに彼らが出現した後、腋窩枝を削除することをお勧めします。
パート2：細菌培養
1日目：
- アッセイで使用されているすべての菌株に対してプレートまたは培養物は同時に開始されます。 シュードモナス属用。これは、凍結グリセロールストック（表2）から適切な抗生物質を含有KBMプレート上に2誘導と3チャレンジ株、ストリークの細菌が含まれています。細菌少量のプレートの中央に分散させる必要があります。約18〜24時間30℃でインキュベートする。 、30をアグロバクテリウムの場合は、新鮮なプレートから2 mlのLBで液体培養を開始し、250 rpmで一晩成長℃、
2日目：
- 膿の場合は、細菌に液体KBMの150〜200μlのを追加し、滅菌ガラススプレッダーを使用して全体のプレート上にそれらを広げ。バックインキュベーター内でプレートを入れて、それは別の20〜24時間成長させる。良好な成長を示す、次の日プレート上に細菌の芝生があるはずです。 アグロバクテリウムの場合は、、30を20μMのアセトシリンゴンで約5-10 mlのLBで二次培養を開始し、250 rpmで20時間に一晩成長させ℃に
パート3：分析のための準備植物
2日目：
- ある日、アッセイ前に植物が22から24の部屋° C、〜35から40パーセントRHと一定の光に移動する必要があります。
- 太い黒のマーカーを用いて直径で少なくとも1.5 cmの葉上に円をマーク。 2〜4つの円は葉ごとにマークすることができます。円はよく等間隔であり、好ましくは大静脈と交差させない。よく、展開葉を選択してください。タフやタッチに厚いものと葉の下側部分に円をマーキング避ける古い葉または葉を避けてください。
前の実験に一日の円をマークすると、プロトコルに必須ではありません。しかし、それは、アッセイされる植物が多数ある場合は時間を節約し、それが容易PTIの誘導とチャレンジ接種との間の正確なタイミングを達成できるようになります。
パート4：PTIの誘導
3日目：
- P.蛍光菌とP.ために10mMのMgCl 2でプレートから細胞を収集するプチダ 。 アグロバクテリウムのために、細胞を収集する文化を遠心し、10mMのMgCl 2の + 10mMのMES pHを5.6に再懸濁します。のMgCl 2 - MESソリューションで遠心分離と再懸濁しますを繰り返します。 600nmでの細胞の光学密度（OD）を測定します。表2に記載されている最後の必要な値に5.1mmに調整します。 膿が最終のMgCl 2 - MESソリューションで10mMのMgCl 2及びアグロバクテリウムに再懸濁してください。 25mlの総容積は約40〜50スポットを接種するのに十分です。
- 1ミリリットル無針注射器を使用して葉上で事前にマークした円にPTIの誘導物質を浸透させる。植物が浸透していた順序と浸潤が開始された正確な時間を書き留めておきます。
パート5：チャレンジ接種
- P.を準備シリン PV。 トマト DC3000、一部4.1および表2に記載のように挑戦は PST DC3000ΔhopQ1 - 1と PS PV。 コナジラミ 。
- 誘導が行われたとして、七時間デューサの浸潤後、植物の同じ順序でチャレンジ浸潤を実行します。一般的に、最初の接種の円の外周上の点は2回目接種の円の中心として使用することができます。葉の上に複数のスポットが存在する場合、浸潤が重複していないことを確認してください。
- 正確なCFUの数を決定するために適切な抗生物質を含有KBMまたはLBプレート上でアッセイで使用されているすべてのカルチャのプレート連続希釈。
パート6：PTIの内訳についてはスコアリング
5日目：
- pstファイル DC3000でチャレンジしたスポットのETIによる細胞死の外観を探します。浸潤の重複するエリア内の細胞死は、PTIの内訳を示していると肯定的な表現型として採点してください。
7日目：
- pstファイルDC3000ΔhopQ1 - 1または PS PVで挑戦されたスポットの疾患に起因する細胞死の外観を探します。 コナジラミは、
コントロール植物（PTIのために妥協すべきではないことが）浸透のオーバーラップ領域で細胞死を示すために開始すると、それ以上の観測を行う停止。
パート7：代表的な結果
図1は、アッセイP.の結果を示しています。 蛍光菌は、チャレンジとしてデューサと PST DC3000として使用されました。
図1。P. 蛍光菌はN.に浸潤したbenthamiana葉（黒丸）は、PTIを誘導するために、7時間後、スポットが PST DC3000（白い丸）に挑戦された。 FLS2のために沈黙の植物は、P.地域でPTIの内訳を示した蛍光菌は 、（）に浸潤などの細胞死が見られた。沈黙されていないコントロールの植物はPTI（B）の誘導に起因する重複領域には細胞死を示さなかった。赤い矢印が不足または浸潤のオーバーラップ領域における細胞死の存在を示している。写真は2日間浸潤した後に採取した。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。
| PTIの誘導物質 | 細胞死誘発の挑戦 | 細胞死の性質 | コードは |
| 蛍光菌 55 | シュードモナスシリン PV トマト（PST。）DC3000 6 | ETI | PF / DC |
| P.プチダ KT2440 | pstファイル DC3000 | ETI | PP / DC |
| P.蛍光菌 55 | pstファイルDC3000ΔhopQ1 - 1 6 | 病気 | Pf/Q1-1 |
| アグロバクテリウムツメファシエンス GV2260 | P.シリン PV。タバコ11528R | 病気 | アグロ/ Ptab |
表1：PTIの誘導とPTIのための細胞死アッセイで使用される細胞死-引き出す微生物の組み合わせ。
| 細菌株 | 選択培地 | 最後のODは、実験で使用 | 対応するCFU / mlの |
| P.蛍光菌 55 | KBMアンピシリン（100 ug / mlと） | 0.5 | 1 × 10 9 |
| P.プチダ KT2440 | KBMアンピシリン（100 ug / mlと） | 0.5 | 1 × 10 8 |
| A.ツメファシエンス GV2260 | LBリファンピシン（100 ug / mlと） | 0.5 | 5 × 10 8 |
| pstファイル DC3000 | KBMリファンピシン（100 ug / mlと） | 0.02 | 2 × 10 7 |
| pstファイルDC3000ΔhopQ1 - 1 | KBMリファンピシン（100 ug / mlと） | 0.1の100倍希釈 | 1 × 10 6 |
| P.シリン PV。タバコ11528R | KBMリファンピシン（100 ug / mlと） | 0.1の100倍希釈 | 1 × 10 6 |
表2：培養条件およびアッセイで使用されている接種レベル。 ODと対応するCFUレベルは、分光光度計の異なるブランド間で異なる場合があります。
Discussion
細胞死ベースのアッセイは、PTIにおける遺伝子の関与を決定するために使用することができます。例えば、目的遺伝子の機能喪失型変異体は、このアッセイを用いてテストすることができます。インデューサーと、表1に与えられた課題の接種の4の組み合わせのうち、これが唯一の組み合わせは、ご使用のプラントバックグラウンドでの表現型をもたらすかもしれないことが可能です。我々はFLS2ために沈黙の植物は、インデューサーと挑戦接種のPF / DCとPf/Q1-1組み合わせでPTIの内訳（表1）を示すことを観察した。
それは、アッセイのための環境条件は、パート3.1で説明したものにできる限り近いことが重要です。低湿度では、スコアの分析が困難、あまりにも速く進行する細胞死を引き起こす。我々のプロトコルで記述された条件は、ラボでは動作しない場合は、インデューサーまたはチャレンジ接種のレベルを変更してみてください。我々は短い時間のギャップがアッセイはコントロール植物に早すぎると分解を引き起こしたことを発見したが、変更可能な別のパラメータには、誘導と課題間の時間差です。
我々は、少なくとも4〜5植物が実験でテストされると正の表現型は少なくとも3-4の独立した実験で繰り返されることをお勧めします。
Acknowledgments
我々は、貴重な議論のため惠淑ああ、ジョアントムモレロとアランCollmer、植物病理学および植物 - 微生物の生物学、コーネル大学、学科に感謝。我々は記事にコメントをジェシーMunkvoldに感謝。資金は、全米科学財団の植物ゲノムのプログラム、受賞番号DBI - 0605059（GBM）によって提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
