Summary
En cell death-baserad analys för PTI i Nicotiana benthamiana växter beskrivs.
Abstract
Att uppfatta potentiella patogener i deras miljö, växter använder mönsterigenkänning receptorer (PRRS) som finns på deras plasma membran. PRRS erkänner bevaras mikrobiella funktioner kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) och denna upptäckt leder till PAMP-utlöst immunitet (PTI), som effektivt förhindrar kolonisering av vegetabiliska vävnader av icke-patogener 1,2. Den mest studerade systemet i PTI är FLS2-beroende väg 3. FLS2 erkänner PAMP flg22 som är en del av bakteriell flagellin.
Framgångsrika patogener har virulensfaktorer eller effektenheter som kan undertrycka PTI och låta patogenen att orsaka sjukdom 1. Vissa växter i sin tur har resistensgener som upptäcker effektenheter eller sin verksamhet, vilket leder till effektormedierad utlöses immunitet (ETI) 2.
Vi beskriver en celldöd-baserad analys av PTI ändras från Oh och Collmer 4. Analysen var standardiserade i N. benthamiana, som används allt mer som ett modellsystem för att studera växt-patogen interaktioner 5. PTI framkallas genom infiltration av en icke-patogena bakterier stam i löv. Sju timmar senare orsakar en bakteriestam som antingen sjukdom eller som aktiverar ETI är infiltreras i ett område som överlappar den ursprungliga infiltration zonen. PTI inducerad av den första infiltrationen kan fördröja eller förhindra uppkomsten av celldöd grund av den andra utmaningen infiltration. Omvänt visar utseendet av celldöd i det överlappande området ympning en uppdelning av PTI.
Fyra olika kombinationer av hämmare av PTI och vaccinationer utmaning var standardiserade (tabell 1). Analysen testades på icke tystas, N. benthamiana anläggningar som fungerade som kontroll och växter tystas för FLS2 som förutspås bli äventyras på deras förmåga att utveckla PTI.
Protocol
Del 1: växternas tillväxt och underhåll
Nicotiana benthamiana växter som används i analysen bör vara ca 7 veckor gamla. De bör trimmas minst 4-5 dagar före analysen att ta bort alla axillär grenar och blommor. Det är en bra idé att ta bort armhålan grenar snart efter de dyker upp för att göra växterna mer hanterbar.
Del 2: bakteriekultur
DAG 1:
- Plattor eller kulturer för alla stammar som används i analysen initieras på samma gång. För Pseudomonas spp.. som omfattar 2 inducerare och 3 stammar utmaning, bakterier strimma på KBM tallrikar med lämplig antibiotika från fryst glycerol lager (tabell 2). En liten mängd bakterier ska spridas i mitten av plattan. Inkubera plattan vid 30 ° C i ca 18-24 timmar. För Agrobacterium, starta en flytande kultur i 2 ml LB från en ny platta och växa övernattning på 250 rpm, 30 ° C.
DAG 2:
- För Pseudomonas, lägg till 150-200 l vätska KBM till bakterier och sprida dem över hela plattan med en steril glas spridare. Sätt plattan tillbaka i kuvösen och låta det växa i ytterligare 20-24 timmar. Det bör finnas en bakteriell gräsmatta på plattan nästa dag, vilket visar god tillväxt. För Agrobacterium, starta en sekundär kultur i ca 5-10 ml LB med 20 mikroM acetosyringone och låta det växa över natten till 20 timmar vid 250 rpm, 30 ° C.
Del 3: Förbereda anläggningar för analysen
DAG 2:
- En dag innan analysen växterna ska flyttas till ett rum på 22-24 ° C, ~ 35-40% relativ luftfuktighet och konstant ljus.
- Markera cirklar på bladen som är minst 1,5 cm i diameter med en tjock svart markering. Två till fyra cirklar kan markeras per blad. Cirklarna ska vara väl placerade och helst inte korsa en stor ven. Välj väl ut blad. Undvik äldre blad eller blad som är svåra eller tjocka vid beröring och undvika märkning cirklar på den nedre delar av blad.
Märkning cirklar en dag före experimentet är inte nödvändigt att protokollet. Men, det sparar tid om det finns ett stort antal växter som analyseras, och gör det lättare att uppnå exakt timing mellan induktion av PTI och vaccinationer utmaning.
Del 4: Induktion av PTI
DAG 3:
- Harvest cellerna från plattan i 10 mM MgCl 2 för P. fluorescens och P. putida. För Agrobacterium, centrifugera kulturen att samla in celler och återsuspendera i 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Upprepa centrifugeringen och återsuspendera i MgCl 2-MES-lösning. Mät den optiska densiteten (OD) i cellerna vid 600 nm. Justera ODS till den slutliga krävs värden enligt Tabell 2. Pseudomonas äntligen borde resuspenderas i 10 mM MgCl 2 och Agrobacterium i MgCl 2-MES-lösning. En total volym på 25 ml är tillräckligt för att inympa ca 40-50 platser.
- Infiltrera PTI inducerare i pre-märkt cirklar på bladen med en 1 ml needleless spruta. Skriv ner den ordning i vilken växterna var infiltrerade och den exakta tidpunkt då infiltration inleddes.
Del 5: Challenge inympning
- Förbered P. syringae pv. tomat DC3000, Pst DC3000 Δ hopQ1-1 och Ps pv. tabaci för utmaningen som beskrivs i del 4.1 och tabell 2.
- Sju timmar efter inducerare infiltration, utföra utmaningen infiltration i samma ordning av växter som induktion gjordes. Generellt kan en punkt på periferin av den första inokulationen cirkeln användas som centrum för den andra inokulationen cirkeln. Om det finns flera fläckar på ett löv sedan se till att infiltrationer inte överlappar varandra.
- Plate spädningar av alla kulturer används i analysen på KBM eller LB plattor som innehåller lämpliga antibiotika för att fastställa det exakta CFU nummer.
Del 6: Poäng för uppdelning av PTI
Dag 5:
- Leta efter uppkomsten av celldöd grund av ETI på de platser som utmanade med Pst DC3000. Celldöd inom överlappande området infiltration visar en uppdelning av PTI och ska bedömas som en positiv fenotyp.
Dag 7:
- Leta efter uppkomsten av celldöd grund av sjukdom i de platser som utsattes för Pst DC3000 Δ hopQ1-1 eller PS pv. Tabaci
När kontrollen växter (som inte ska äventyras för PTI) börja visa celldöd i det överlappande området infiltration, sluta göra några ytterligare kommentarer.
Del 7: representativa resultat
Figur 1 visar resultatet av en analys när P. fluorescens användes som inducerar och Pst DC3000 som utmaning.
Figur 1. P. fluorescens var infiltrerad på N. benthamiana blad (svart cirkel) för att inducera PTI och 7 timmar senare, var platsen utmanas med Pst DC3000 (vit cirkel). Växter tystas för FLS2 visade en uppdelning av PTI i den region där P. fluorescens var infiltrerad (A), som ses av celldöd. Kontroll växter som inte tystades visade ingen celldöd i det överlappande området på grund av induktion av PTI (B). Röda pilarna visar brist på, eller förekomst av celldöd i det överlappande området infiltration. Fotografier tagna 2 dagar efter infiltreringar. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
| PTI inducerare | Celldöd-framkallande utmaning | Typ av celldöd | Kod |
| Pseudomonas fluorescens 55 | Pseudomonas syringae pv tomat (PST). DC3000 6 | ETI | Pf / DC |
| P. putida KT2440 | Pst DC3000 | ETI | PP / DC |
| P. fluorescens 55 | Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 | Sjukdom | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | P. syringae pv. tabaci 11528R | Sjukdom | Agro / Ptab |
Tabell 1: Kombinationer av PTI inducera och celldöd-framkallande mikroorganismer som används i celldöd analys för PTI.
| Bakteriestam | Val medelstora | Final OD används i experiment | Motsvarande CFU / ml |
| P. fluorescens 55 | KBM Ampicillin (100 ug / ml) | 0,5 | 1 x 10 9 |
| P. putida KT2440 | KBM Ampicillin (100 ug / ml) | 0,5 | 1 x 10 8 |
| A. tumefaciens GV2260 | LB Rifampicin (100 mg / ml) | 0,5 | 5 x 10 8 |
| Pst DC3000 | KBM Rifampicin (100 mg / ml) | 0,02 | 2 x 10 7 |
| Pst DC3000 Δ hopQ1-1 | KBM Rifampicin (100 mg / ml) | 100 gånger utspädning på 0,1 | 1 x 10 6 |
| P. syringae pv. tabaci 11528R | KBM Rifampicin (100 mg / ml) | 100 gånger utspädning på 0,1 | 1 x 10 6 |
Tabell 2: Kultur villkor och nivåer inokulat används i analysen. OD och motsvarande CFU nivåerna kan variera mellan olika fabrikat av spektrofotometrar.
Discussion
Den celldöd-baserad analys kan användas för att fastställa förekomsten av en gen i PTI. Till exempel kan bortfall av funktionen mutanter för en gen av intresse testas med hjälp av denna analys. Av de fyra kombinationer av inducerare och vaccinationer utmaning som anges i tabell 1 är det möjligt att endast en kombination kan resultera i en fenotyp i din anläggning bakgrunden. Vi har observerat att växter tystas för FLS2 visar en uppdelning av PTI i pf / DC och Pf/Q1-1 kombinationer av inducerare och vaccinationer utmaning (tabell 1).
Det är viktigt att de miljömässiga förutsättningarna för analysen är så nära som möjligt de som beskrivs i del 3.1. Låg fuktighet orsakar celldöd att gå för snabbt, vilket gör analysen svår att göra mål. Om de villkor som beskrivs i våra protokoll inte fungerar i ditt labb, sedan försöka ändra nivån på inducerare eller utmana ympningen. En annan parameter som kan ändras är tiden mellan induktion och utmaning, men vi har funnit att kortare luckor orsakade analysen att bryta ner för snabbt under kontroll växter.
Vi rekommenderar att minst 4-5 anläggningar testas i ett experiment och en positiv fenotyp bör upprepas i minst 3-4 oberoende försök.
Acknowledgments
Vi tackar Hye-Sook Åh, Joanne Morello och Alan Collmer, Institutionen för växt-patologi och Växt-mikrob Biologi, Cornell University, för värdefulla diskussioner. Vi tackar Jesse Munkvold för kommentarer på artikeln. Finansieringen kom från National Science Foundation växt Genome Program, utmärkelse antal DBI-0605059 (GBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
