Summary
Een cel dood-gebaseerde test voor het PTI in Nicotiana benthamiana planten is beschreven.
Abstract
Waar te nemen potentiële ziekteverwekkers in hun omgeving, planten gebruiken patroonherkenning receptoren (PRRS) aanwezig op hun plasma-membranen. PRRS herkennen bewaard microbiële eigenschappen genoemd pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en deze detectie leidt tot PAMP-triggered immuniteit (PTI), die effectief kolonisatie van plantaardige weefsels voorkomt door niet-pathogenen 1,2. De meest bestudeerde systeem in PTI is de FLS2-afhankelijke route 3. FLS2 erkent de PAMP flg22 dat is een onderdeel van bacteriële flagelline.
Succesvolle ziekteverwekkers bezitten virulentiefactoren of effectoren die kunnen onderdrukken PTI en laat de pathogeen de ziekte een te veroorzaken. Sommige planten op hun beurt hebben resistentiegenen die effectoren of hun activiteit, wat leidt tot effector-triggered immuniteit (ETI) 2 te detecteren.
Beschrijven we een celdood-gebaseerde test voor het PTI gewijzigd ten opzichte van Oh en Collmer 4. De test werd gestandaardiseerd in N. benthamiana, die wordt steeds vaker gebruikt als een modelsysteem voor de studie van plant-pathogeen interacties 5. PTI is veroorzaakt door infiltratie van een niet-pathogene bacteriestam in de bladeren. Zeven uur later, een bacteriestam die ervoor zorgt dat een ziekte of die activeert ETI is geïnfiltreerd in een gebied overlappen de oorspronkelijke infiltratie zone. PTI veroorzaakt door de eerste infiltratie in staat is te vertragen of te voorkomen de schijn van celdood als gevolg van de tweede uitdaging infiltratie. Omgekeerd, het uiterlijk van celdood in het overlappende gebied van inenting geeft een overzicht van PTI.
Vier verschillende combinaties van inductoren van PTI en uitdaging inentingen waren gestandaardiseerd (tabel 1). De test werd getest op niet-zwijgen N. benthamiana planten die diende als de controle-en planten zwijgen voor FLS2 die voorspeld worden aangetast in hun vermogen om PTI te ontwikkelen.
Protocol
Deel 1: Plantengroei en onderhoud
Nicotiana benthamiana planten die in de test moet ongeveer 7 weken oud. Ze moeten worden ontdaan van ten minste 4-5 dagen voorafgaand aan de test om alle oksel takken en bloemen te verwijderen. Het is een goed idee om binnenkort te verwijderen oksel takken nadat ze ontstaan in zodat de planten beter beheersbaar.
Deel 2: Bacteriële cultuur
DAG 1:
- Platen of culturen van alle stammen die in de test worden geïnitieerd op hetzelfde moment. Voor de Pseudomonas spp. waaronder twee inductoren en 3 uitdaging stammen, streep bacteriën op KBM platen met de juiste antibiotica van bevroren glycerol voorraden (tabel 2). Een kleine hoeveelheid bacteriën moet worden verspreid over het midden van de plaat. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende ongeveer 18-24 uur. Voor Agrobacterium, start een vloeibare cultuur in 2 ml LB van een verse plaat en groeien 's nachts bij 250 rpm, 30 ° C.
DAG 2:
- Voor Pseudomonas, voeg 150 tot 200 pl van vloeistof KBM de bacteriën en verdeel ze over de gehele plaat met behulp van een steriele glazen strooier. Zet de plaat terug in de incubator en laten groeien voor een ander 20-24 uur. Er moet een bacteriële grasveld op de plaat de volgende dag worden, met vermelding van een goede groei. Voor Agrobacterium, start een tweede cultuur in ongeveer 5-10 ml LB met 20 iM acetosyringone en laat het 's nachts tot 20 uur groeien bij 250 rpm, 30 ° C.
Deel 3: Voorbereiden van planten voor de test
DAG 2:
- Een dag voor de test van de planten moet worden verplaatst naar een kamer bij 22-24 ° C, ~ 35-40% RV en constant licht.
- Markeer cirkels op bladeren die ten minste 1,5 cm in diameter met een dikke zwarte stift. Twee tot vier cirkels kunnen worden gemarkeerd per blad. De cirkels moet goed verdeeld en bij voorkeur niet over een grote ader. Kies een goed uitgebouwd bladeren. Voorkomen dat oudere bladeren of bladeren die zijn moeilijk of dik aanvoelt en vermijd markering cirkels op de lagere delen van het blad.
Markering cirkels een dag voorafgaand aan het experiment is niet essentieel voor het protocol. Echter, het bespaart u tijd als er grote aantallen van planten worden getest, en maakt het makkelijker te bereiken nauwkeurige timing tussen de inductie van PTI en uitdaging inentingen.
Deel 4: Inductie van PTI
DAG 3:
- Oogst de cellen van de plaat in 10 mM MgCl 2 voor P. fluorescens en P. putida. Voor Agrobacterium, centrifuge de cultuur cellen te verzamelen en resuspendeer in 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Herhaal het centrifugeren en resuspendeer in de MgCl 2-MES-oplossing. Meet de optische dichtheid (OD) van de cellen bij 600 nm. Stel de ODS tot de uiteindelijke gewenste waarden zoals beschreven in Tabel 2. Pseudomonas Ten slotte mag niet worden gesuspendeerd in 10 mM MgCl 2 en Agrobacterium in de MgCl 2-MES-oplossing. Een totaal volume van 25 ml is voldoende om ongeveer 40-50 plekken inoculeren.
- Infiltreren het PTI inductoren in de pre-gemarkeerde cirkels op de bladeren met behulp van een 1 ml zonder naald spuit. Noteer de volgorde waarin de planten waren geïnfiltreerd en de exacte tijd waarop de infiltratie was begonnen.
Deel 5: Challenge inoculatie
- Bereid P. syringae pv. tomaat DC3000, Pst DC3000 Δ hopQ1-1 en Ps pv. tabaci voor de uitdaging, zoals beschreven in deel 4.1 en Tabel 2.
- Zeven uur na de inductor infiltratie, voert u de uitdaging infiltratie in dezelfde orde van planten als de inductie werd gedaan. In het algemeen kan een punt aan de rand van de eerste inenting cirkel gebruikt worden als het centrum van de tweede inenting cirkel. Als er meerdere vlekken op een blad zorg dan dat de infiltraties elkaar niet overlappen.
- Plaat seriële verdunningen van alle culturen die in de test op de KBM-of LB-platen met de juiste antibiotica om het exacte aantal CFU te bepalen.
Deel 6: Scoren voor afbraak van PTI
Dag 5:
- Kijk voor het verschijnen van celdood als gevolg van ETI in de plekken die werden uitgedaagd met Pst DC3000. Celdood in het overlappende gebied van infiltratie geeft een overzicht van PTI en dient te worden gescoord als een positief fenotype.
Dag 7:
- Kijk voor het verschijnen van celdood als gevolg van ziekte in de plekken die werden uitgedaagd met Pst DC3000 Δ hopQ1-1 of Ps pv. Tabaci
Wanneer de controle planten (die niet mag worden aangetast voor het PTI) beginnen te celdood show in het overlappende gebied van infiltratie, stoppen met het maken een verdere waarnemingen.
Deel 7: Representatieve resultaten
Figuur 1 toont het resultaat van een test bij het P. fluorescens werd gebruikt als de inductor en Pst DC3000 als de uitdaging.
Figuur 1. P. fluorescens was geïnfiltreerd op N. benthamiana bladeren (zwarte cirkel) naar PTI te induceren en 7 uur later, de plek werd uitgedaagd met Pst DC3000 (witte cirkel). Planten zwijgen voor FLS2 toonde een specificatie van PTI in de regio waar P. fluorescens was geïnfiltreerd (A), zoals gezien door celdood. Controle planten die niet zwijgen toonde geen celdood in het overlappende gebied als gevolg van inductie van PTI (B). Rode pijlen geven een gebrek aan of aanwezigheid van celdood in het overlappende gebied van infiltratie. Foto's werden genomen 2 dagen na de infiltraties. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
| PTI inductor | Celdood-uitlokken uitdaging | Aard van celdood | Code |
| Pseudomonas fluorescens 55 | Pseudomonas syringae pv tomaat (Pst.) DC3000 6 | ETI | Pf / DC |
| P. putida KT2440 | Pst DC3000 | ETI | Pp / DC |
| P. fluorescens 55 | Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 | Ziekte | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | P. syringae pv. tabaci 11528R | Ziekte | Agro / Ptab |
Tabel 1: Combinaties van PTI induceren en celdood-uitlokken van microben die in de cel dood test voor PTI.
| Bacteriestam | Selectiemedium | Laatste OD worden gebruikt in experiment | Overeenkomstige CFU / ml |
| P. fluorescens 55 | KBM Ampicilline (100 ug / ml) | 0.5 | 1 x 10 9 |
| P. putida KT2440 | KBM Ampicilline (100 ug / ml) | 0.5 | 1 x 10 8 |
| A. tumefaciens GV2260 | LB Rifampicine (100 ug / ml) | 0.5 | 5 x 10 8 |
| Pst DC3000 | KBM Rifampicine (100 ug / ml) | 0.02 | 2 x 10 7 |
| Pst DC3000 Δ hopQ1-1 | KBM Rifampicine (100 ug / ml) | 100-voudige verdunning van 0,1 | 1 x 10 6 |
| P. syringae pv. tabaci 11528R | KBM Rifampicine (100 ug / ml) | 100-voudige verdunning van 0,1 | 1 x 10 6 |
Tabel 2: Cultuur voorwaarden en inoculum niveaus worden gebruikt in de test. De OD en de bijbehorende CFU niveaus kan variëren tussen de verschillende merken van spectrofotometers.
Discussion
De celdood-gebaseerde test kan worden gebruikt om de betrokkenheid van een gen in PTI te bepalen. Zo kan het verlies-van-functie mutanten voor een gen van interesse worden getest met deze test. Van de vier combinaties van inductor en uitdaging inentingen gegeven in tabel 1, is het mogelijk dat slechts een combinatie kan resulteren in een fenotype in uw installatie achtergrond. We hebben gezien dat planten zwijgen voor FLS2 een specificatie van PTI in het Pf / DC en Pf/Q1-1 combinaties van inductor en uitdaging inentingen (tabel 1) laten zien.
Het is essentieel dat de milieu-omstandigheden voor de bepaling zo dicht mogelijk bij de beschreven in deel 3.1. Lage luchtvochtigheid veroorzaakt celdood om door te gaan te snel, waardoor de test moeilijk om te scoren. Als de voorwaarden zoals beschreven in ons protocol werken niet in uw laboratorium, probeer dan het veranderen van de hoogte van de inductor of uitdaging inenting. Een andere parameter die kan worden gewijzigd is de tijd tussen inductie en uitdaging, maar we hebben gemerkt dat de kortere tijd hiaten de oorzaak van de test af te breken te snel in controle planten.
We raden ten minste 4-5 planten worden getest in een experiment en een positief fenotype moet worden herhaald in minstens 3-4 onafhankelijke experimenten.
Acknowledgments
Wij danken Hye-Sook Oh, Joanne Morello en Alan Collmer, Departement Plant Pathologie en Plant-Microbe Biologie, Cornell University, voor waardevolle discussies. Wij danken Jesse Munkvold voor commentaar op het artikel. De financiering werd verstrekt door de National Science Foundation Plant Genome Program, award aantal DBI-0605059 (GBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
