Summary
A la mort cellulaire à base d'analyse pour PTI dans les plantes de Nicotiana benthamiana est décrite.
Abstract
Pour percevoir des agents pathogènes potentiels dans leur environnement, les plantes utilisent Pattern Recognition Receptors (PRR) présents sur leurs membranes plasmiques. PRR reconnaître les caractéristiques microbiennes conservées appelé pathogène motifs moléculaires associés (PAMP) et cela conduit à la détection PAMP déclenché par l'immunité (PTI), qui empêche efficacement la colonisation des tissus de la plante par des non-pathogènes 1,2. Le système le plus étudié dans PTI est le 3 voie FLS2-dépendante. FLS2 reconnaît le flg22 PAMP qui est une composante de la flagelline bactérienne.
Pathogènes réussissent possèdent des facteurs de virulence ou des effecteurs qui peuvent supprimer PTI et permettre à l'agent pathogène à causer la maladie 1. Certaines plantes possèdent à leur tour des gènes de résistance qui permettent de détecter des effecteurs ou leur activité, ce qui conduit à effecteur déclenché par l'immunité (ETI) 2.
Nous décrivons une mort cellulaire à base d'analyse pour PTI modifié depuis Oh et Collmer 4. Le test a été normalisé en N. benthamiana, qui est en plus utilisées comme un système modèle pour l'étude des interactions plante-pathogène 5. PTI est induite par l'infiltration d'une souche non pathogène bactérien dans les feuilles. Sept heures plus tard, une souche bactérienne qui cause la maladie ou qui actionne ETI est infiltré dans une zone de chevauchement de la zone d'infiltration d'origine. PTI induite par l'infiltration premier est capable de retarder ou d'empêcher l'apparition de la mort cellulaire due à l'infiltration deuxième défi. Inversement, l'apparition de la mort cellulaire dans la zone de chevauchement de l'inoculation indique une panne de PTI.
Quatre combinaisons différentes avec des inducteurs du PTI et inoculations défi ont été normalisées (tableau 1). Le dosage a été testé sur la non-taire N. benthamiana qui a servi de contrôle et de silence pour les plantes qui ont été prédites FLS2 d'être compromises dans leur capacité à développer PTI.
Protocol
Partie 1: La croissance des plantes et l'entretien
Nicotiana benthamiana utilisé dans le dosage devrait être d'environ 7 semaines. Ils doivent être taillés au moins 4-5 jours avant le test d'enlever toutes les branches et les fleurs axillaires. C'est une bonne idée d'enlever les branches axillaires, peu après leur apparition afin de rendre les plantes plus gérable.
Partie 2: culture bactérienne
JOUR 1:
- Assiettes ou des cultures de toutes les souches utilisées dans le test sont lancés au même moment. Pour les Pseudomonas spp. qui comprennent deux inducteurs et 3 souches d'épreuve, les bactéries série sur des plaques contenant KBM les antibiotiques appropriés de stocks de glycérol congelé (tableau 2). Une petite quantité de bactéries doivent être répartis sur le centre de la plaque. Incuber la plaque à 30 ° C pendant environ 18-24 heures. Pour Agrobacterium, démarrer une culture liquide en 2 ml LB à partir d'une plaque fraîche et poussent durant la nuit à 250 rpm, 30 ° C.
JOUR 2:
- Pour Pseudomonas, ajouter 150 à 200 l de liquide à la KBM bactéries et les étaler sur toute la plaque à l'aide d'un épandeur de verre stériles. Mettez la plaque arrière dans l'incubateur et le laisser grandir pour un autre 20-24 heures. Il devrait y avoir une pelouse sur la plaque bactérienne, le lendemain, indiquant une bonne croissance. Pour Agrobacterium, démarrer une culture secondaire dans environ 5-10 ml LB avec 20 acétosyringone pM et laisser pousser durant la nuit de 20 heures à 250 rpm, 30 ° C.
Partie 3: Préparation des plantes pour le dosage
JOUR 2:
- Un jour avant le dosage des plantes devrait être transféré dans une chambre à 22-24 ° C, ~ 35-40% de lumière RH et constante.
- Marquer les cercles sur les feuilles qui sont au moins 1,5 cm de diamètre en utilisant un gros marqueur noir. Deux à quatre cercles peuvent être marqués par feuille. Les cercles doivent être bien espacées et de préférence pas traverser une grosse veine. Choisissez bien élargi feuilles. Evitez les feuilles plus âgées ou les feuilles qui sont durs ou épais au toucher et éviter de marquer des cercles sur la partie inférieure de la feuille.
Marquage des cercles d'une journée avant l'expérience n'est pas indispensable pour le protocole. Cependant, il fait gagner du temps s'il ya un grand nombre de plantes à détecter, et le rend plus facile à réaliser une synchronisation précise entre l'induction de PTI et inoculations défi.
Partie 4: Induction de PTI
JOUR 3:
- Récolter les cellules de la plaque dans 10 mM MgCl 2 pour P. fluorescens et P. putida. Pour Agrobacterium, centrifuger la culture pour recueillir des cellules et de remettre en suspension dans 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Répétez la centrifugation et la remise en suspension dans le MgCl 2-MES solution. Mesurer la densité optique (DO) des cellules à 600 nm. Réglez le SACO à des valeurs finales nécessaires tel que décrit dans le tableau 2. Pseudomonas devrait être finalement remis en suspension dans 10 mM de MgCl2 et Agrobacterium dans le MgCl 2-MES solution. Un volume total de 25 ml est suffisante pour inoculer environ 40-50 points.
- Infiltrez les inducteurs PTI dans les cercles pré-marqués sur les feuilles à l'aide d'une seringue de 1 ml sans aiguille. Notez l'ordre dans lequel les plantes ont été infiltrés et le moment exact où l'infiltration a été commencé.
Partie 5: inoculation d'épreuve
- Préparer P. syringae pv. tomates DC3000, DC3000 Pst Δ hopQ1-1 et Ps pv. tabaci à relever le défi que décrit dans la partie 4.1 et le tableau 2.
- Sept heures après l'infiltration inducteur, effectuer l'infiltration défi dans le même ordre de plantes que l'induction a été effectué. Généralement, un point sur la périphérie du cercle première inoculation peut être utilisé comme le centre du cercle deuxième inoculation. S'il ya des taches multiples sur une feuille, puis assurez-vous que les infiltrations ne se chevauchent pas.
- Dilutions plaque de série de toutes les cultures utilisées pour l'essai sur des plaques KBM ou LB contenant les antibiotiques appropriés pour déterminer le nombre exact UFC.
Partie 6: Notation de la rupture du PTI
Jour 5:
- Cherchez l'apparence de la mort cellulaire due à l'ETI dans les endroits qui ont été contestées avec Pst DC3000. La mort cellulaire à l'intérieur de la zone de chevauchement de l'infiltration indique une panne de PTI et doivent être comptés comme un phénotype positif.
Jour 7:
- Cherchez l'apparence de la mort cellulaire due à la maladie dans les endroits qui ont été contestées avec Pst DC3000 Δ hopQ1-1 ou Ps pv. Tabaci
Lorsque les plantes de contrôle (qui ne devrait pas être compromis pour PTI) commencent à montrer la mort cellulaire dans la zone de chevauchement de l'infiltration, arrêter de faire d'autres observations.
Partie 7: Les résultats représentatifs
La figure 1 montre les résultats d'un essai lorsque P. fluorescens a été utilisé comme inducteur et DC3000 Pst comme le défi.
Figure 1. P. fluorescens a été infiltré sur N. benthamiana feuilles (cercle noir) pour induire PTI et 7 heures plus tard, le spot a été contestée avec Pst DC3000 (cercle blanc). Plantes silence pour FLS2 a montré une rupture de PTI dans la région où P. fluorescens a été infiltré (A), tel que vu par la mort cellulaire. Contrôle des plantes qui n'ont pas été réduits au silence n'a montré aucune mort cellulaire dans la zone de chevauchement en raison de l'induction de PTI (B). Les flèches rouges indiquent l'absence ou la présence de la mort cellulaire dans la zone de chevauchement de l'infiltration. Les photographies ont été prises 2 jours après l'infiltration. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.
| Inducteur PTI | Mort cellulaire provoquant défi | Nature de la mort cellulaire | Code de |
| Pseudomonas fluorescens 55 | Pseudomonas syringae pv tomate (Pst). DC3000 6 | ETI | Pf / DC |
| P. putida KT2440 | Pst DC3000 | ETI | Pp / DC |
| P. fluorescens 55 | Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 | Maladie | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | P. syringae pv. tabaci 11528R | Maladie | Agro / PTAB |
Tableau 1: Combinaisons d'induire la mort cellulaire et de PTI-susciter des microbes utilisés dans le dosage de la mort cellulaire par PTI.
| Souche bactérienne | Milieu de sélection | DO finale utilisée dans l'expérience | Correspondant UFC / ml |
| P. fluorescens 55 | KBM Ampicilline (100 ug / ml) | 0.5 | 1 x 10 9 |
| P. putida KT2440 | KBM Ampicilline (100 ug / ml) | 0.5 | 1 x 10 8 |
| A. tumefaciens GV2260 | LB Rifampicine (100 ug / ml) | 0.5 | 5 x 10 8 |
| Pst DC3000 | KBM rifampicine (100 ug / ml) | 0,02 | 2 x 10 7 |
| Pst DC3000 Δ hopQ1-1 | KBM rifampicine (100 ug / ml) | 100 de dilution de 0,1 fois | 1 x 10 6 |
| P. syringae pv. tabaci 11528R | KBM rifampicine (100 ug / ml) | 100 de dilution de 0,1 fois | 1 x 10 6 |
Tableau 2: Les conditions de culture et de niveaux d'inoculum utilisé dans le dosage. La DO et les niveaux correspondants UFC peut varier entre différentes marques de spectrophotomètres.
Discussion
Dosage de la mort basée sur la cellule peut être utilisée pour déterminer l'implication d'un gène dans le PTI. Par exemple, la perte de fonction des mutants pour un gène d'intérêt peut être testée en utilisant ce dosage. Sur les quatre combinaisons d'inducteur et inoculations défi, étant donné dans le tableau 1, il est possible que seule une combinaison peut entraîner un phénotype dans votre fond végétal. Nous avons observé que les plantes réduit au silence pour FLS2 montrent une répartition de PTI dans le Pf / DC et des combinaisons de Pf/Q1-1 inducteur et inoculations défi (tableau 1).
Il est essentiel que les conditions environnementales pour le dosage sont aussi proches que possible de celles décrites dans la partie 3.1. Faible taux d'humidité provoque la mort cellulaire de procéder trop rapidement, ce qui rend le dosage difficile de marquer. Si les conditions décrites dans notre protocole ne fonctionne pas dans votre laboratoire, alors essayez de modifier le niveau d'inducteur ou d'inoculation d'épreuve. Un autre paramètre qui peut être modifié, c'est l'écart de temps entre l'induction et le défi, mais nous avons constaté que les écarts de temps plus courte causé le dosage de briser trop rapidement dans les plantes de contrôle.
Nous recommandons que au moins 4-5 plantes être testée dans une expérience et un phénotype positif doit être répété dans au moins 3-4 expériences indépendantes.
Acknowledgments
Nous remercions Hye-Sook Oh, Joanne Morello et Alan Collmer, Département de pathologie végétale et plante-microbe Biologie, Université Cornell, à des discussions utiles. Nous remercions Jesse Munkvold des commentaires sur l'article. Le financement a été fourni par le Programme National Science Foundation génome des plantes, le nombre récompense DBI-0605059 (GBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
