Summary
Nicotiana benthamiana पौधों में कोशिका मृत्यु आधारित पीटीआई के लिए परख वर्णित है.
Abstract
अपने वातावरण में संभावित रोगज़नक़ों अनुभव करने के लिए, पौधों का उपयोग पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) अपने प्लाज्मा झिल्ली पर मौजूद है. PRRs संरक्षित माइक्रोबियल रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) कहा जाता है सुविधाओं को समझते हैं और यह पता लगाने के PAMP ट्रिगर (पीटीआई) प्रतिरक्षा, जो प्रभावी रूप से गैर - रोगज़नक़ों 1,2 द्वारा संयंत्र के ऊतकों की उपनिवेशण रोकता होता. पीटीआई में सबसे अच्छी तरह से अध्ययन प्रणाली मार्ग FLS2 3 निर्भर है. FLS2 PAMP flg22 है कि बैक्टीरियल flagellin का एक घटक है पहचानता है.
सफल रोगज़नक़ों विषैलापन कारकों या effectors कि पीटीआई को दबाने और रोगज़नक़ 1 बीमारी का कारण करने की अनुमति कर सकते हैं अधिकारी. बदले में कुछ पौधों प्रतिरोध जीन है कि effectors या उनकी गतिविधि है, जो effector ट्रिगर (ETI) रोगक्षमता 2 करने के लिए सुराग का पता लगाने के अधिकारी हैं.
हम पीटीआई के लिए एक सेल मौत आधारित परख ओह, और 4 Collmer से संशोधित वर्णन . परख एन में मानकीकृत किया गया था benthamiana, जो संयंत्र रोगज़नक़ 5 बातचीत के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है तेजी से. पीटीआई पत्तियों में एक गैर रोगजनक जीवाणु तनाव की घुसपैठ से प्रेरित है. सात घंटे बाद, एक जीवाणु तनाव है कि या तो इस बीमारी का कारण बनता है या जो सक्रिय ETI एक मूल घुसपैठ क्षेत्र अतिव्यापी क्षेत्र में घुसपैठ है. पहली घुसपैठ द्वारा प्रेरित पीटीआई देरी या सेल दूसरी चुनौती घुसपैठ के कारण मौत की उपस्थिति को रोकने में सक्षम है. इसके विपरीत, टीका के अतिव्यापी क्षेत्र में कोशिका मृत्यु की उपस्थिति पीटीआई के टूटने का संकेत है.
पीटीआई चुनौती और inoculations के inducers के चार विभिन्न संयोजनों मानकीकृत थे (1 टेबल). परख गैर खामोश एन पर परीक्षण किया गया था benthamiana पौधों है कि नियंत्रण और FLS2 के लिए खामोश पौधों है कि उनके पीटीआई विकसित करने की क्षमता में समझौता होने की भविष्यवाणी की थी के रूप में सेवा की.
Protocol
भाग 1: संयंत्र के विकास और रखरखाव
Nicotiana benthamiana परख में इस्तेमाल पौधों के बारे में 7 सप्ताह पुराने होना चाहिए. वे कम से कम 4-5 दिनों छंटनी की परख के लिए पहले किया जाना चाहिए सभी कक्षा शाखाओं और फूलों को हटाने. यह कक्षा शाखाओं जल्दी ही हटाने के बाद वे उभरने क्रम में पौधों को और अधिक प्रबंधनीय बनाने के लिए एक अच्छा विचार है.
भाग 2: बैक्टीरियल संस्कृति
1 दिन:
- प्लेट्स या संस्कृतियों परख में इस्तेमाल सभी उपभेदों के लिए एक ही समय पर शुरू कर रहे हैं. Pseudomonas एसपीपी के लिए . जो inducers 2 और 3 चुनौती उपभेदों, KBM प्लेटों पर लकीर बैक्टीरिया जमी ग्लिसरॉल शेयरों (तालिका 2) से उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त शामिल हैं. जीवाणुओं की एक छोटी राशि की थाली के केन्द्र पर फैलाया जाना चाहिए. 30 ° C पर लगभग 18-24 घंटे के लिए थाली को सेते हैं. Agrobacterium के लिए, 2 मिलीलीटर लेग में एक ताजा थाली से एक तरल संस्कृति और शुरू 250 rpm पर रातोंरात बढ़ने, 30 डिग्री सेल्सियस
दिन 2:
- Pseudomonas के लिए, बैक्टीरिया को तरल KBM के 150-200 μl जोड़ने और उन्हें पूरे एक बाँझ कांच स्प्रेडर का उपयोग थाली पर फैल . थाली इनक्यूबेटर में वापस रखो और इसे एक और 20-24 घंटे के लिए विकसित. अगले दिन की थाली पर एक जीवाणु लॉन हो सकता है, अच्छी वृद्धि का संकेत चाहिए. Agrobacterium के लिए, के बारे में 20 सुक्ष्ममापी acetosyringone के साथ 5-10 मिलीलीटर लेग में एक माध्यमिक संस्कृति शुरू और इसे 250 rpm, 30 पर 20 घंटे रातोंरात बढ़ने डिग्री सेल्सियस
भाग 3: परख के लिए पौधों की तैयारी
दिन 2:
- एक दिन पहले परख संयंत्र 22-24 पर एक कमरे में स्थानांतरित किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस ~ 35-40% आरएच और लगातार प्रकाश.
- पत्ते कि व्यास में कम से कम 1.5 सेमी मोटी काले मार्कर का उपयोग कर रहे हैं पर मार्क हलकों. पत्ता प्रति दो से चार हलकों के रूप में चिह्नित किया जा सकता है है. हलकों अच्छी तरह से स्थान दिया गया हो और अधिमानतः एक बड़ी शिरा पार नहीं करना चाहिए. अच्छी तरह से विस्तार पत्ते चुनें. बड़े पत्ते या पत्तियों कि कठिन या स्पर्श करने के लिए मोटी हैं और पत्ती के निचले भाग पर हलकों अंकन से बचने से बचें.
चिह्नित प्रयोग करने के लिए पहले एक दिन हलकों प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक नहीं है. हालांकि, यह समय है अगर वहाँ जा रहा है assayed पौधों की बड़ी संख्या हैं बचाता है, और यह आसान पीटीआई की प्रेरण और चुनौती inoculations के बीच सटीक समय प्राप्त करने के लिए बनाता है.
भाग 4: पीटीआई की प्रेरण
3 दिन:
- पी. fluorescens और पी. के लिए 10 मिमी 2 MgCl में थाली से कोशिकाओं हार्वेस्ट putida. Agrobacterium के लिए, संस्कृति अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 10mm MgCl 2 + 10 मिमी एमईएस 5.6 पीएच में resuspend. Centrifugation और MgCl समाधान 2 - एमईएस में resuspend दोहराएँ. 600 एनएम कोशिकाओं के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) उपाय. अंतिम आवश्यक रूप MgCl में तालिका 2 में वर्णित Pseudomonas के अंत में 10 मिमी में resuspended किया जाना चाहिए 2 MgCl और Agrobacterium 2 एमईएस समाधान मानों को ods समायोजित करें. 25 मिलीलीटर की कुल मात्रा के बारे में 40-50 स्पॉट टीका लगाना करने के लिए पर्याप्त है.
- एक 1 मिलीलीटर needleless सिरिंज का उपयोग कर के पत्तों पर पूर्व चिह्नित हलकों में पीटीआई inducers घुसपैठ. नीचे के क्रम में जो पौधों घुसपैठ थे और सही समय है जब घुसपैठ शुरू हो गया था लिखो.
भाग 5: चैलेंज टीका
- पी. तैयार syringae pv DC3000 टमाटर, pst DC3000 hopQ1-1 Δ और चुनौती के रूप में 4.1 हिस्सा है और तालिका 2 में वर्णित के लिए पी एस pv tabaci.
- सात घंटे inducer घुसपैठ के बाद, पौधों की एक ही क्रम में चुनौती घुसपैठ प्रदर्शन के रूप में प्रेरण किया गया था. आम तौर पर, पहला टीका चक्र की परिधि पर एक बिंदु दूसरा टीका चक्र के केंद्र के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. अगर वहाँ एक पत्ती पर कई धब्बे होते हैं, तो यकीन है कि घुसपैठ नहीं ओवरलैप करते हैं.
- सभी संस्कृतियों KBM या लेग उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेटों पर परख में प्रयोग किया जाता सटीक CFU संख्या निर्धारित की प्लेट धारावाहिक dilutions.
भाग 6: पीटीआई के टूटने के लिए स्कोरिंग
दिन 5:
- स्पॉट है कि PST DC3000 के साथ चुनौती दी थी में कोशिका मृत्यु का कारण ETI उपस्थिति के लिए देखो. घुसपैठ के अतिव्यापी क्षेत्र के अंदर सेल मौत पीटीआई के टूटने का संकेत है और एक सकारात्मक phenotype के रूप में रन बनाए होना चाहिए.
7 दिन:
- कोशिका मृत्यु का कारण रोग के लिए स्पॉट है कि PST DC3000 Δ hopQ1-1 या पी एस pv के साथ चुनौती दी थी में उपस्थिति के लिए देखो tabaci .
जब नियंत्रण पौधों (पीटीआई लिए समझौता नहीं किया जाना चाहिए) घुसपैठ के अतिव्यापी क्षेत्र में कोशिका मृत्यु को दिखाने शुरू, किसी भी आगे की टिप्पणियों बनाने बंद करो.
भाग 7: प्रतिनिधि के परिणाम
चित्रा 1 पी. जब परख के परिणाम से पता चलता है fluorescens inducer और चुनौती के रूप में पीएसटी DC3000 के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
चित्रा 1 पी.. fluorescens एन पर घुसपैठ किया गया था benthamiana पत्तियों (काले वृत्त) ने उत्पन्न करने के लिए और 7 घंटे बाद मौके pst DC3000 (सफेद वृत्त) के साथ चुनौती दी गई थी . FLS2 संयंत्रों के लिए खामोश जहां पी. क्षेत्र में पीटीआई के एक टूटने से पता चला fluorescens (ए) घुसपैठ किया गया था, के रूप में कोशिका मृत्यु से देखा. नियंत्रण पौधों है कि नहीं खामोश थे अतिव्यापी पीटीआई (बी) के शामिल होने के कारण क्षेत्र में कोई कोशिका मृत्यु से पता चला है. लाल तीर की कमी या कोशिका मृत्यु की घुसपैठ के अतिव्यापी क्षेत्र में उपस्थिति से संकेत मिलता है. फोटो घुसपैठ के 2 दिन बाद ले जाया गया. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
| पीटीआई inducer | मौत eliciting चुनौती सेल | कोशिका मृत्यु की प्रकृति | कोड |
| Pseudomonas 55 fluorescens | Pseudomonas syringae pv (. Pst) टमाटर 6 DC3000 | ETI | पीएफ / डीसी |
| पी. putida KT2440 | Pst DC3000 | ETI | पीपी / डीसी |
| पी. 55 fluorescens | Pst DC3000 hopQ1-1 6 Δ | रोग | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | पी. syringae pv. tabaci 11528R | रोग | / एग्रो Ptab |
तालिका 1: पीटीआई उत्प्रेरण और सेल के युग्म मौत eliciting पीटीआई के लिए कोशिका मृत्यु परख में इस्तेमाल किया रोगाणुओं .
| बैक्टीरियल तनाव | चयन मध्यम | अंतिम ओवर ड्राफ्ट प्रयोग में इस्तेमाल किया | अनुरूप CFU / एमएल |
| पी. 55 fluorescens | KBM एम्पीसिलीन (100 स्नातकीय / एमएल) | 0.5 | 1 10 x 9 |
| पी. putida KT2440 | KBM एम्पीसिलीन (100 स्नातकीय / एमएल) | 0.5 | 1 10 x 8 |
| ए tumefaciens GV2260 | लेग रिफैम्पिसिन (100 स्नातकीय / एमएल) | 0.5 | 5 10 x 8 |
| Pst DC3000 | KBM रिफैम्पिसिन (100 स्नातकीय / एमएल) | 0.02 | 2 10 x 7 |
| Pst DC3000 hopQ1-1 Δ | KBM रिफैम्पिसिन (100 स्नातकीय / एमएल) | 0.1 के 100 गुना कमजोर पड़ने | 1 10 x 6 |
| पी. syringae pv. tabaci 11528R | KBM रिफैम्पिसिन (100 स्नातकीय / एमएल) | 0.1 के 100 गुना कमजोर पड़ने | 1 10 x 6 |
तालिका 2: संस्कृति और शर्तों inoculum स्तर परख में इस्तेमाल किया. आयुध डिपो और इसी CFU स्तर spectrophotometers के विभिन्न ब्रांड के बीच भिन्न हो सकते हैं.
Discussion
कोशिका मृत्यु आधारित परख पीटीआई में एक जीन की भागीदारी निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, ब्याज की एक जीन के लिए नुकसान के समारोह म्यूटेंट इस परख का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है. Inducer और चुनौती तालिका 1 में दी गई inoculations के 4 संयोजन के से, यह संभव है कि केवल एक संयोजन अपने संयंत्र की पृष्ठभूमि में एक phenotype में परिणाम कर सकते हैं. हमने देखा है कि FLS2 पौधों के लिए खामोश फाल्सीपेरम / डीसी और inducer और चुनौती inoculations (1 टेबल) के Pf/Q1-1 संयोजन में पीटीआई के एक बे्रकडाउन शो.
यह आवश्यक है कि परख के लिए पर्यावरण की स्थिति के रूप में 3.1 पार्ट में वर्णित उन लोगों के लिए संभव के रूप में बंद कर रहे हैं. कम नमी कोशिका मृत्यु का कारण बनता है बहुत तेजी से आगे बढ़ना, परख स्कोर करने के लिए मुश्किल बना. यदि हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों अपनी प्रयोगशाला में काम नहीं करते, तो चुनौती या टीका inducer के स्तर में फेरबदल करने की कोशिश करें. एक और पैरामीटर संशोधित किया जा सकता है कि प्रेरण और चुनौती के बीच समय अंतराल है, हालांकि हमने पाया है कि कम समय अंतराल परख नीचे तोड़ने के लिए नियंत्रण पौधों में भी जल्दी कारण.
हम अनुशंसा करते हैं कि कम से कम 4-5 पौधों एक प्रयोग में परीक्षण किया है और एक सकारात्मक phenotype कम से कम 3-4 स्वतंत्र प्रयोगों में दोहराया जाना चाहिए.
Acknowledgments
हम बहुमूल्य विचार - विमर्श के लिए हाय - Sook ओह, Joanne मोरेल्लो और एलन Collmer प्लांट पैथोलॉजी और संयंत्र - जीवविज्ञान सूक्ष्म जीव विभाग, कॉर्नेल विश्वविद्यालय, धन्यवाद. हम लेख पर टिप्पणी के लिए जेसी Munkvold धन्यवाद. अनुदान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन प्लांट जीनोम प्रोग्राम द्वारा प्रदान की गई थी, पुरस्कार संख्या DBI 0605059 (जीबीएम).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
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- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
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