Summary
Uma célula de ensaio de morte com base em plantas para PTI Nicotiana benthamiana é descrito.
Abstract
Para perceber patógenos potenciais em seu ambiente, as plantas usam receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) presentes nas membranas seu plasma. PRRs reconhecer recursos microbianos conservada chamado patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs) e isso leva à detecção de PAMP disparado imunidade (PTI), o que efetivamente previne a colonização de tecidos vegetais por patógenos não 1,2. O sistema mais bem estudado no PTI é a via de três FLS2-dependente. FLS2 reconhece a flg22 PAMP que é um componente dos flagelos bacterianos.
Patógenos de sucesso possuem fatores de virulência ou efetores que pode suprimir PTI e permitir que o patógeno para causar a doença 1. Algumas plantas, por sua vez possuem genes de resistência que detectam efetores ou sua atividade, o que leva a efetoras disparado imunidade (ETI) 2.
Descrevemos uma célula de ensaio da morte-based para PTI modificado a partir Ah, e Collmer 4. O ensaio foi padronizado em N. benthamiana, que está sendo usado cada vez mais como um sistema modelo para o estudo da planta-patógeno interações 5. PTI é induzida pela infiltração de uma cepa não-patogênica bacteriana em folhas. Sete horas depois, uma cepa bacteriana que causa a doença tanto ou que ativa ETI é infiltrado em uma área de sobreposição da zona de infiltração original. PTI induzida pela infiltração primeiro é capaz de retardar ou prevenir o aparecimento de morte celular, devido à infiltração segundo desafio. Por outro lado, a aparência de morte celular na área de sobreposição de inoculação indica uma repartição dos PTI.
Quatro combinações diferentes de indutores do PTI e inoculações desafio foram padronizados (Tabela 1). O ensaio foi testado em não-silenciadas N. benthamiana plantas que serviram como controle e plantas silenciadas para FLS2 que estava previsto para ser comprometida em sua capacidade de desenvolver PTI.
Protocol
Parte 1: O crescimento das plantas e manutenção
Nicotiana benthamiana plantas utilizada no ensaio deve ser de cerca de 7 semanas de idade. Eles devem ser aparadas pelo menos 4-5 dias antes do ensaio para remover todos os ramos axilares e flores. É uma boa idéia para remover ramos axilares logo depois que eles surgem de forma a tornar as plantas mais facilmente gerenciáveis.
Parte 2: cultura bacteriana
DIA 1:
- Placas ou culturas de todas as estirpes utilizadas no ensaio são iniciadas ao mesmo tempo. Para a Pseudomonas spp. que incluem dois indutores e 3 cepas desafio, bactérias raia em placas KBM contendo os antibióticos adequados de estoques congelados glicerol (Tabela 2). Uma pequena quantidade de bactérias deve ser espalhado no centro do prato. Incubar as placas a 30 ° C por cerca de 18-24 horas. Para Agrobacterium, iniciar uma cultura líquida em duas LB ml de uma placa nova e crescer durante a noite a 250 rpm, 30 ° C.
2 º DIA:
- Por Pseudomonas, adicione 150-200 mL de KBM líquido para as bactérias e espalhe-os sobre a placa inteira usando um espalhador de vidro estéril. Coloque o prato de volta na incubadora e deixá-lo crescer por mais 20-24 horas. Deve haver um gramado bacteriana na placa no dia seguinte, indicando um bom crescimento. Para Agrobacterium, iniciar uma cultura secundária em cerca de 50-10 ml LB com 20 mM acetosyringone e deixá-lo crescer durante a noite para 20 horas a 250 rpm, 30 ° C.
Parte 3: Estações Preparação para o ensaio
2 º DIA:
- Um dia antes do ensaio as plantas devem ser movido para um quarto em 22-24 ° C, luz ~ 35-40% de umidade relativa e constante.
- Mark círculos em folhas que são pelo menos 1,5 cm de diâmetro com um marcador preto grosso. Dois a quatro círculos podem ser marcados por folha. Os círculos devem ser bem espaçadas e de preferência não atravessar uma grande veia. Escolha bem-expandida folhas. Evitar que as folhas velhas ou folhas que são difíceis ou grossa ao toque e evitar a marcação círculos nas partes inferior da folha.
Círculos marcando um dia antes do experimento não é essencial para o protocolo. No entanto, ele economiza tempo se houver um grande número de plantas que estão sendo analisadas, e faz com que seja mais fácil de conseguir o sincronismo preciso entre a indução da PTI e inoculações desafio.
Parte 4: Indução da PTI
DIA 3:
- Colher as células a partir da placa em 10 mM MgCl 2 para P. fluorescens e P. putida. Para Agrobacterium, centrifugar a cultura para coletar células e ressuspender em 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Repetir a centrifugação e ressuspender em solução de 2-MES MgCl. Medir a densidade óptica (DO) das células a 600 nm. Ajustar o ODS para os valores finais necessários conforme descrito na Tabela 2. Pseudomonas deve ser finalmente ressuspenso em 10 mM MgCl 2 e Agrobacterium na MgCl 2-MES solução. Um volume total de 25 ml é suficiente para inocular cerca de 40-50 pontos.
- Infiltrar no PTI indutores para os círculos pré-marcadas nas folhas utilizando uma seringa de 1 ml sem agulha. Anote a ordem em que as plantas foram infiltradas eo tempo exato em que a infiltração foi iniciada.
Parte 5: inoculação Desafio
- Prepare P. syringae pv tomate. DC3000, Pst DC3000 Δ hopQ1-1 e Ps pv. tabaci para o desafio, tal como descrito na parte 4.1 e Tabela 2.
- Sete horas após a infiltração indutor, executar a infiltração desafio na mesma ordem de plantas como a indução foi feito. Geralmente, um ponto na periferia do círculo primeira inoculação pode ser usado como o centro do círculo segunda inoculação. Se há pontos múltiplos em uma folha, em seguida, certifique-se as infiltrações não se sobrepõem.
- Diluições placa de série de todas as culturas utilizadas no ensaio de KBM ou LB placas contendo os antibióticos apropriados para determinar o número exato UFC.
Parte 6: A pontuação para repartição do PTI
Dia 5:
- Olhe para o surgimento de morte celular por ETI os pontos que foram desafiados com Pst DC3000. Morte celular dentro da área de sobreposição de infiltração indica uma repartição dos PTI e deve ser marcado como um fenótipo positivo.
Dia 7:
- Olhe para o surgimento de morte celular devido à doença nos locais que foram desafiados com Pst DC3000 Δ hopQ1-1 ou pv Ps. Tabaci
Quando as plantas controle (que não deve ser comprometida por PTI) começam a mostrar a morte celular na área de sobreposição de infiltração, parar de fazer quaisquer observações adicionais.
Parte 7: resultados Representante
A Figura 1 mostra o resultado de um ensaio quando P. fluorescens foi usado como indutor e DC3000 Pst como o desafio.
Figura 1. P. fluorescens foi infiltrada em N. benthamiana folhas (círculo preto) para induzir a PTI e 7 horas depois, o local foi desafiado com Pst DC3000 (círculo branco). Plantas silenciadas para FLS2 mostrou um colapso da PTI na região onde P. fluorescens foi infiltrada (A), como visto por morte celular. Plantas controle que não foram silenciadas não mostrou a morte celular na área de sobreposição devido à indução da PTI (B). Setas vermelhas indicam ausência ou presença de morte celular na área de sobreposição de infiltração. Fotografias foram tiradas dois dias após a infiltrações. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
| Indutor PTI | Morte celular provocando desafio | Natureza da morte celular | Código |
| Pseudomonas fluorescens 55 | Pseudomonas syringae pv tomato (Pst). DC3000 6 | ETI | Pf / DC |
| P. putida KT2440 | Pst DC3000 | ETI | Pp / DC |
| P. fluorescens 55 | Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 | Doença | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | P. syringae pv. tabaci 11528R | Doença | Agro / ptab |
Tabela 1: Combinações de PTI induzir e morte celular provocando micróbios usados no ensaio para a morte celular PTI.
| Estirpe bacteriana | Meio de seleção | Finais OD usado em experimento | CFU correspondente / ml |
| P. fluorescens 55 | KBM Ampicilina (100 ug / ml) | 0,5 | 1 x 10 9 |
| P. putida KT2440 | KBM Ampicilina (100 ug / ml) | 0,5 | 1 x 10 8 |
| A. tumefaciens GV2260 | LB Rifampicina (100 ug / ml) | 0,5 | 5 x 10 8 |
| Pst DC3000 | KBM Rifampicina (100 ug / ml) | 0,02 | 2 x 10 7 |
| Pst DC3000 Δ hopQ1-1 | KBM Rifampicina (100 ug / ml) | 100 de diluição de 0,1 vezes | 1 x 10 6 |
| P. syringae pv. tabaci 11528R | KBM Rifampicina (100 ug / ml) | 100 de diluição de 0,1 vezes | 1 x 10 6 |
Tabela 2: Condições de cultura e níveis de inóculo utilizado no ensaio. O OD e níveis correspondentes UFC pode variar entre diferentes marcas de espectrofotômetros.
Discussion
A célula de ensaio de morte podem ser usadas para determinar o envolvimento de um gene no PTI. Por exemplo, perda de função mutantes para um gene de interesse pode ser testado com este ensaio. Das 4 combinações de indutor e inoculações desafio dada na Tabela 1, é possível que apenas uma combinação pode resultar em um fenótipo em seu fundo de plantas. Temos observado que as plantas silenciadas para FLS2 mostrar uma avaria do PTI na Pf / DC e Pf/Q1-1 combinações de indutor e inoculações desafio (Tabela 1).
É essencial que as condições ambientais para o ensaio são o mais próximo possível às descritas na parte 3.1. A baixa umidade provoca a morte celular para continuar rápido demais, tornando o ensaio difícil de marcar. Se as condições descritas no nosso protocolo não funcionam em seu laboratório, em seguida, tentar alterar o nível de indutor ou inoculação desafio. Outro parâmetro que pode ser modificado é o intervalo de tempo entre indução e desafio, embora tenhamos encontrado que as lacunas de tempo mais curto fez com que o ensaio de quebrar muito rapidamente em plantas controle.
Recomendamos que, pelo menos, 4-5 plantas ser testado em um experimento e um fenótipo positivo deve ser repetido em pelo menos 3-4 experimentos independentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Hye Sook-Oh, Joanne Morello e Alan Collmer, Departamento de Fitopatologia e Biologia Vegetal-Microbe, Cornell University, pelas valiosas discussões. Agradecemos a Jesse Munkvold para comentários sobre o artigo. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation Programa Genoma Plant, número prêmio DBI-0605059 (GBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
