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Biology

फैटी एसिड में मात्रात्मक Phosphoproteomics प्रेरित Saccharomyces cerevisiae Published: October 12, 2009 doi: 10.3791/1474
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Systems Biology

Summary

एक मात्रात्मक phosphorylation cryolysis, यूरिया solubilziation, HILIC fractionation और phosphorylated पेप्टाइड्स के iMac संवर्धन का उपयोग प्रक्रिया का विवरण.

Abstract

इस प्रोटोकॉल isotopically भारी और प्रकाश एस cerevisiae कोशिकाओं के फैटी एसिड oleate, के साथ विकास और उत्तेजना का वर्णन करता है. कक्ष एक गेंद मिल चक्की और जिसके परिणामस्वरूप यूरिया solubilization द्वारा समाधान में लाया grindate में एक cryolysis प्रक्रिया का उपयोग कर भूमि रहे हैं. यह प्रक्रिया एक metabolically निष्क्रिय स्थिति में कोशिकाओं के lysis के लिए अनुमति देता है, phosphorylation के संरक्षण और सेल lysis के दौरान phosphoproteome के पुनरभिविन्यास को रोकने. कमी, alkylation, trypsin प्रोटीन के पाचन के बाद, नमूने C18 स्तंभों और नमूना हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (HILIC) का उपयोग fractionation द्वारा कम जटिलता पर desalted हैं. HILIC स्तंभों preferentially हाइड्रोफिलिक अणुओं है जो अच्छी तरह से phosphoproteomics के लिए अनुकूल है बनाए रखने. Phosphorylated पेप्टाइड्स के बाद गैर phosphorylated समकक्षों की तुलना में chromatographic प्रोफ़ाइल में elute करते हैं. Fractionation के बाद, phosphopeptides immobilized धातु क्रोमैटोग्राफी, जो phosphopeptide संवर्धन के लिए प्रभारी आधारित समानताएं पर निर्भर करता है का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं. इस प्रक्रिया के अंत में नमूने के मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार हैं.

Protocol

सेल विकास और मीडिया

  1. एक 1.0 एक न्यूनतम खमीर मध्यम के दो 1 लीटर संस्कृतियों (0.17% अमोनियम सल्फेट या अमीनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस, 0.5% अमोनियम सल्फेट) में बीज तो BY4742Δarg4Δlys1 100 एक 600 आयुध डिपो एमएल अमीर मीडिया में रातोंरात कोशिकाओं के एक एकल कॉलोनी युक्त (; Isotec 13 सी 6 15 N 4) और lysine (13 सी 6 15 N 2; Isotec) अमीनो एसिड, 20mg एल / isotopically सामान्य या भारी arginine के के साथ पूरक का पूरा के पूरक हैं.
  2. कोशिकाओं को 18 घंटे के लिए बड़े हो रहे थे 1.8 के 600 आयुध डिपो . यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को कम से कम 9 पीढ़ियों के माध्यम से जाने के लिए लेबल आइसोटोप का पूरा समावेश हासिल है. प्रकाश नमूना pelleted था, बाँझ पानी से धोया, reseeded एक मध्यम (isotopically सामान्य arginine और lysine, 0.2% Oleate (सिग्मा रसायन) और 0.5% 40 बीच (सिग्मा रसायन)) युक्त oleate में और एक और 85 मिनट के लिए प्रेरित किया. यह एक isotopically प्रकाश arginine और lysine के लिए सम्मान के साथ, पैदावार, नमूना और एक isotopically भारी संदर्भ ग्लूकोज हो नमूना oleate उत्तेजित.

सेल lysis अलगाव, और पेप्टाइड्स के Fractionation

  1. अपकेंद्रित्र बोतल वजन. 3 मिनट के लिए centrifugation द्वारा हार्वेस्ट नमूने. मीडिया निकालें और अतिरिक्त तरल aspirate. गोली बोतल और तब तरल नाइट्रोजन में फ्रीज फ़्लैश वजन (आमतौर पर 1-2 ग्राम के बीच निकलेगा). 'पीस' बफर की गोली वजन करने के लिए तरल नाइट्रोजन (फास्फेट खारा buffered (Pbs, Gibco), 10% ग्लिसरॉल, protease inhibitors (SigmaFAST Protease अवरोध करनेवाला गोलियाँ, सिग्मा) में जमे हुए छर्रों के लिए एक मात्रा बराबर और जोड़ें हॉल्ट फॉस्फेट inhibitors (थर्मो वैज्ञानिक )).
  2. तरल नाइट्रोजन में पीस पोत रुक. रुको जब तक तरल नाइट्रोजन उबलते रहता है. पीस पोत को गोली जमे हुए गेंद बीयरिंगों के साथ, स्थानांतरण.
  3. 600 rpm पर 1 मिनट 20 सेकंड के साथ 3 मिनट के लिए एक दिशा उलटा चक्र के साथ पीस. तरल नाइट्रोजन में पीस पोत Refreeze. 15 मिनट कुल पीस समय के लिए 4 से अधिक बार दोहराएँ.
  4. एक 50ml फाल्कन ट्यूब जगह सूखी बर्फ में जमे हुए grindate लीजिए. ° जब तक सी -80 में स्टोर करने के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है.
  5. 8M यूरिया, 0.1M अमोनियम बिकारबोनिट, 0.1M Tris पीएच 8.6 की एक 10ml समाधान करें. जमी grindate 1 की मात्रा (यूरिया बफर के उदाहरण 3mls के लिए PBS बफर के 1 मिलीलीटर के साथ एक 1 ग्राम गोली जोड़ी) के लिए यूरिया बफर के 3 संस्करणों जोड़ें. तुरंत एक जांच टिप sonicator (- 10 सेकंड दालों दो) के साथ मिश्रण sonicate. टिप ट्यूब समाधान के foaming को रोकने के नीचे के पास रखें. grindate तुरंत समाधान में जाना चाहिए.
  6. Centrifugation द्वारा 5 मिनट के लिए 4 में lysate साफ़ डिग्री सेल्सियस
  7. ताजा ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
  8. 0.5m Tris की एक ताजा विभाज्य [carboxyethyl 2] phosphine (TCEP). 1:100 पर एक 5mm अंतिम एकाग्रता के लिए नमूना में जोड़ें. 37 पर सेते ° एच. 1 के लिए सी
  9. कम cysteines के Alkylation. कमरे के तापमान शांत करने के लिए अनुमति दें. 1M iodoacetamide की एक ताजा विभाज्य बनाओ. अंधेरे में रखें (हम ट्यूब पन्नी में लपेटो). 20mm के एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ें. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में सेते हैं.
  10. एक एच. के लिए कमरे के तापमान पर एक 1M स्टॉक से 20mm डीटीटी के साथ iodoacetamide बुझाने
  11. एक मानक ब्रैडफोर्ड या बीसीए परख (नहीं) में वर्णित के साथ प्रोटीन यों. एसडीएस नीचे पृष्ठ के द्वारा विश्लेषण के लिए एक नमूना ले लो.
  12. भारी आइसोटोप का समावेश मान्य करने के लिए, कम और alkylated lysate 100 μl का उपयोग करें. Sonicate पतला 01:04 DH 2 हे के साथ, और 50:1 trypsin करने के लिए प्रोटीन पर trypsin जोड़ें . 4 घंटे की एक न्यूनतम, सूखी नमूना एक Vac और C18 Ultramicrospin स्तंभों (नेस्ट समूह) के साथ तो फीका बनाना गति में नीचे के लिए डाइजेस्ट.
    1. Acetonitrile के 100 μl साथ हाइड्रेट स्तंभ
    2. 200 μl 0.1% TFA के साथ संतुलित करना.
    3. 200 μl 0.1% TFA में सूखी नमूना Resuspend. स्तंभ पर लोड. ~ 200 XG या न्यूनतम कॉलम के माध्यम से प्रवाह के लिए आवश्यक गति पर अपकेंद्रित्र.
    4. 200 μl 0.1% TFA के साथ दो बार धोएं.
    5. के साथ दो बार Elute 50 μl 60% Acetonitrile, 0.1% TFA के साथ.
    6. एक Vac गति में सूखी नमूना.
    7. 20 μl 0.1% चींटी एसिड में Resuspend नमूना. एक मास स्पेक्ट्रोमीटर पर 2 μl चलाएँ. Isotopically भारी arginine और संबंधित मी / z स्पेक्ट्रा में 10 और 8 डाल्टन बदलाव के द्वारा lysine के समावेश की जाँच करें. 98% - 96 के बीच प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए समावेश होना चाहिए.
  13. Isotopically भारी और प्रकाश नमूने (प्रोटीन का मिलीग्राम) के बराबर मात्रा में मिलाएं.
  14. 20% मेथनॉल के साथ नमूना 01:04 पतला.
  15. 1:200 पर trypsin जोड़ें. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
  16. जाँचें कि पाचन एसडीएस PAGE द्वारा पूरा करने के लिए चला गया है. भागो predigestion नमूने के 2 और 4 μl और एक 816 μl घ पोस्ट trypsin पचाने में की. Coomassie धुंधला द्वारा कल्पना है कि पाचन पूरा हो गया है. यदि यह पूरा नहीं है, एक जांच टिप sonicator संक्षिप्त के साथ नमूना sonicate और trypsin के साथ फिर से पचाने में.
  17. नमूना एक Vac गति में नीचे सूखी. जब गोली समाधान में चला जाता है जब तक सूखी फ़िल्टर DH 2 हे और भंवर के 200 μl जोड़ने. एक Vac गति में नीचे सूखी नमूना. DH 2 ओ के साथ फिर से Resuspend नमूना फिर से सूखी.
  18. 0.1% Trifluoracetic एसिड में Resuspend गोली (TFA, सिग्मा). जाँच करें कि पीएच 3 के आसपास है पीएच स्ट्रिप्स का उपयोग. यदि जरूरत acidify 10% TFA के साथ.
  19. किसी भी वेग बाहर गोली.
  20. वाटर्स सितम्बर - पाक Vac 500 मिलीग्राम C18 स्तंभ पर नमूने फीका बनाना. क्या अधिभार नहीं इन स्तंभों. अधिकतम राशि 5 मिलीग्राम है, लेकिन यह बेहतर है एक छोटे से कम लोड. यदि आवश्यक एकाधिक स्तंभों के बीच नमूना फूट डालो.
    1. 5 मिलीलीटर 100% acetonitrile के साथ हाइड्रेट स्तंभ. ~ 200 XG या न्यूनतम कॉलम के माध्यम से प्रवाह के लिए आवश्यक गति पर अपकेंद्रित्र.
    2. 5ml TFA 0.1% के साथ स्तंभ संतुलित करना. नमूना लोड. प्रवाह को ले लीजिए और फिर लोड.
    3. 5 मिलीलीटर 0.1% TFA के साथ धोएं. दोहराएँ.
    4. 2ml 60% Acetonitrile, 0.1% TFA के साथ Elute.
    5. एक Vac गति में नीचे सूखी नमूना.

पेप्टाइड Phosphopeptides और Fractionation अलगाव

  1. पेप्टाइड्स एक HILIC स्तंभ पर fractionated हैं. हम TSK जेल एमाइड 80 4.6 मिमी x 25 सेमी एक गार्ड स्तंभ के साथ विश्लेषणात्मक स्तंभ. TOSOH का उपयोग करें इस कदम के साथ अपना समय ले लो, अपने नमूना लोड करने से पहले 2 घंटे के लिए 90% पर स्तंभ A फिर से चलाने के दो रिक्त gradients चलाने. एक स्तंभ है इस आकार XX के आसपास माना जाता है पर अधिकतम लोड, हम आम तौर पर रन प्रति अधिक से अधिक 5 मिलीग्राम लोड नहीं करते.
  2. सॉल्वेंट एक 98% ACN/0.1% TFA -
    सॉल्वेंट बी 2% ACN/0.1% TFA -
    लोड 90% में एक 20 से अधिक, 90% 85% करने के लिए एक से अधिक 5, 85% 60% 40 से अधिक, 60% 0% करने के लिए 5 से अधिक एक ', 0% से अधिक 90% 5 '.
  3. प्रवाह दर 1ml/min है और भिन्न 2 मिनट के अंतराल पर एकत्र किए गए 85 एक 60 से%% एक ढाल पर शुरुआत.
  4. भिन्न कम्बाइन से 10 भागों की संख्या कम है. वृद्धि भिन्न होने की संभावना phosphoproteome के अधिक से अधिक कवरेज निकलेगा.

Phosphopeptides के संवर्धन

  1. Phosphopeptides phos चुनें आयरन आत्मीयता जेल का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं. हम अपने iMac राल के लिए दोहराया फ्रीज विगलन से बचने विभाज्य. 50 mls के एक 250 मिमी एसिटिक एसिड, 30% ACN लोड समाधान करें. एचसीएल के साथ पीएच 2.7 लाओ. लोड समाधान के 500 μl में छर्रों Resuspend. पीएच की जाँच करें, आवश्यक के रूप में एचसीएल या NaOH के साथ समायोजित.
  2. Prewash एक उचित कॉलम में 200 iMac मोतियों की μl. हम Molbiotec स्पिन स्तंभों का उपयोग करें.
    प्रत्येक अंश के लिए एक 50% घोल (समाधान लोड जेल) के 15 μl जोड़ें, और अंत रोटेशन पर अंत के साथ 30 के लिए नमूने 'सेते हैं. विश्लेषण के लिए प्रवाह रखें.
  3. लोड समाधान के साथ धो 3 बार के नमूने और 500 एक बार के साथ μl फ़िल्टर DH ओ 2
  4. 2 के साथ Elute पेप्टाइड्स - 3 मिनट 50 मिमी ना 2 HPO 4 (8.4 पीएच) बफर के 400 μl के साथ . एक गिलास शीशी में स्थानांतरण.
  5. 5 μl 100% चींटी एसिड, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज फ्लैश, और एक Vac गति में सूखे नीचे नमूना के साथ 3 पीएच acidify.
  6. 0.1% TFA और स्वच्छ C18 के रूप में ऊपर वर्णित के 200 μl में Resuspend phosphopeptides. नीचे एक Vac गति में eluted नमूने सूखी.
  7. 0.1% चींटी एसिड के 20 μl में पेप्टाइड्स Resuspend. प्रति मास स्पेक्ट्रोमीटर विश्लेषण 2 μl या के रूप में की जरूरत का उपयोग करें.

नोट्स

इस प्रोटोकॉल के ज्यादा के लिए आप 'अंधा काम किया जाएगा. सेल lysis पश्चिमी सोख्ता और ब्रैडफोर्ड या बीसीए assays, और trypsin पाचन भी आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता द्वारा नजर रखी जा सकती है. HILIC कॉलम इस एक के लिए इसी तरह का पता लगाने दिया, या के रूप में [1, 2] दूसरों को प्रयोग किया जाता है कि तरल क्रोमैटोग्राफी मशीन पर निर्भर करता है के द्वारा देखा. नमूने मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निगरानी कर रहे हैं, जैसे उच्च लागत विश्लेषण के लिए एक उच्च जन सटीकता, उच्च संकल्प मशीन पर जाने से पहले या LCQs MALDIs सस्ती मशीनों पर अपने नमूनों का परीक्षण. अंत में यदि आप एक नीचे में यह एसिड के साथ एक नमूना सुखाने, कांच का उपयोग करें.

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Discussion

इस विधि phosphopeptides कि मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है की एक संवर्धन निकलेगा. मानकों की एक संख्या इस प्रोटोकॉल में बदला जा सकता है, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण पहलू को याद करने के लिए अपने phosphorylation संरक्षित है. मात्रा का ठहराव के लिए कक्षों की तैयारी अलग तरीके की संख्या में प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए अगर आप अपनी कोशिकाओं vivo ICAT के रूप में इस तरह के, टैग में नहीं लेबल कर सकते हैं [3] या ITRAC [4] पोस्ट निष्कर्षण इस्तेमाल किया जा सकते हैं करने के लिए विभिन्न मात्रा का ठहराव के लिए दो संस्कृतियों लेबल प्रयोजनों.

Fractionation के लिए सबसे आम तरीकों एसडीएस PAGE [5, 6] द्वारा जेल fractionation, क्रोमैटोग्राफी SCX [7], और HILIC आधारित [1, 2] क्रोमैटोग्राफी. हम HILIC चुना क्योंकि यह ढाल के अंत तक पेप्टाइड्स बरकरार रखती है, बल्कि SCX लेकिन अन्य समूहों के अन्य तरीकों के साथ अच्छी सफलता मिली है के रूप में ढाल के सामने eluting.

जब iMac का उपयोग कर आप को बढ़ाने या राल की राशि इस्तेमाल किया, ऊष्मायन के समय या washes की संख्या में कमी की आवश्यकता हो सकती है. वहाँ भी अध्ययन किया गया है कि हम यहाँ [8] वर्तमान लोड समाधान के प्रारंभिक रसायन विज्ञान में फेरबदल को देख. तरीकों के इस संयोजन के नमूने है कि 60% के बीच 95% phosphopeptides करने के लिए कर रहे हैं के अलगाव की अनुमति चाहिए. एक बार जब आप अपने खास सिस्टम के लिए एक पद्धति की स्थापना की है आप phosphopeptides की उच्च उपज के लिए सक्षम का अनुकूलन किया जाना चाहिए.

Phosphopeptides के संवर्धन भी TiO 2 के साथ प्राप्त किया जा सकता है [9 10] या phosphoramidite रसायन शास्त्र [11, 12], और अध्ययनों से संकेत दिया है कि प्रत्येक विधि अतिव्यापी phosphoproteome का अभी तक अलग भाग निकलेगा [13]

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Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण और उपयोगी चर्चा के साथ डा. रिच रोजर्स का शुक्रिया अदा करना होगा, और डीआरएस. रोब. Moritz, जेफ Ranish, और उपयोगी विचार - विमर्श के लिए हामिद Mirzai.

इस काम उत्कृष्टता के NIH केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 Sigma-Aldrich 608033
Isotec™ L-Lysine-15N2 Sigma-Aldrich 609021
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid Invitrogen 70011044
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific, Inc. 78420
Retsch PM100 Ball Mill Grinder Retsch 20.540.0001
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar Retsch 01.462.0148
Ultramicrospin C18 column The Nest Group SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18 Waters WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column Tosoh Corp. 13071 This is the HILIC chromatographic column.
Guard column 4.6 mm ID x1 cm Tosoh Corp. 19021 We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel Sigma-Aldrich P9740 This is the IMAC resin. Aliquot and store.

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References

  1. Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
  2. McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
  3. Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
  6. Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
  7. Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
  8. Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
  9. Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  10. Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  11. Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
  12. Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
  13. Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).

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सेलुलर जीवविज्ञान 32 अंक phosphorylation प्रोटिओमिक्स Cryolysis खमीर HILIC iMac Oleate SILAC
फैटी एसिड में मात्रात्मक Phosphoproteomics प्रेरित<em> Saccharomyces cerevisiae</em
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Cite this Article

Saleem, R. A., Aitchison, J. D.… More

Saleem, R. A., Aitchison, J. D. Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (32), e1474, doi:10.3791/1474 (2009).

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