Summary
描述了一个定量的磷酸化过程，使用cryolysis，尿素solubilziation，HILIC分馏和富集磷酸化肽的iMac。
Abstract
这个协议描述的增长和刺激，与同位素重工业和轻工业的酿酒酵母细胞，脂肪酸油酸。细胞是地面使用球磨机研磨机和解决方案所带来的尿素增溶产生的grindate的一个cryolysis程序。此过程允许在新陈代谢处于非活动状态的细胞裂解，维护的磷酸化和防止细胞裂解过程中的磷酸化的方向调整。以下还原，烷基化，胰蛋白酶消化的蛋白质，样品脱盐C18柱和样品的复杂性，降低了使用亲水作用色谱（HILIC）分馏。 HILIC列优先保留，这是适合用于磷酸化的亲水性分子。磷酸化肽往往比非磷酸化的同行色谱个人资料后洗脱。分馏后，使用固定的金属色谱仪，依赖基于电荷的亲和力磷酸浓缩磷酸化是丰富。在此过程结束后的样品准备质谱定量分析。
Protocol
细胞生长和媒体
- 1.0然后将两个1公升文化的一个最小的酵母培养基（0.17％酵母无氮基硫酸铵或氨基酸，0.5％的硫酸铵）的种子细胞，在100 毫升到外径600富媒体BY4742Δarg4Δlys1过夜的一个单菌落含有充分补充氨基酸，辅以20毫克/ L的同位素正常或重精氨酸（13 6 15 N 4的 ; Isotec）和赖氨酸（13 C 6 H 15 N 2; Isotec）。
- 细胞生长18小时，1.8 OD 600。这是至关重要的，至少有9代细胞通过去实现全面纳入标记同位素。光样品的颗粒，用无菌水冲洗，reseeded成一个含中等（同位素正常的精氨酸和赖氨酸，0.2％，油酸（适马化工）和0.5％吐温40（适马化工））的油酸和另外85分钟的刺激。这将产生一个同位素轻，精氨酸和赖氨酸，油酸刺激样本和同位素重的葡萄糖生长的参考样本。
细胞裂解，分离和分馏多肽
- 称取离心瓶。收获样品离心3分钟。删除媒体和吸出多余的液体。称取颗粒和一瓶（通常会产生1-2克之间）然后在液氮中的闪光冻结。添加量相当于颗粒重量的“磨”缓冲区在液氮冷冻颗粒（磷酸盐缓冲液（PBS，GIBCO），10％的甘油，蛋白酶抑制剂（SigmaFAST蛋白酶抑制剂片，西格玛），并停止磷酸酶抑制剂（Thermo Scientific的））。
- 液氮冷冻研磨容器。等待，直到液氮停止沸腾。转移颗粒研磨容器，冷冻球轴承。
- 在600 RPM研磨1分20秒周期为3分钟的方向逆转。重新冷冻在液氮的研磨容器。总研磨时间为15分钟，重复4次以上。
- 收集到一个50毫升猎鹰管处干冰冷冻grindate。贮存于-80 ° C直到准备使用。
- 设为一个8M的尿素，0.1M碳铵，0.1M的Tris pH值8.610毫升溶液。新增3卷尿素缓冲冰冻grindate 1卷（1 ml PBS缓冲液中添加1革兰氏颗粒尿素缓冲的例子3mls）。超声立即用探针尖端sonicator（2 - 10个脉冲）的混合物。保持解决方案的发泡管，以防止底部附近的一角。 grindate应立即进入解决方案。
- 5分钟清除裂解液离心4 ° C。
- 上清转移到新鲜管。
- 新鲜的0.5M三等分[2 - 羧乙基]膦（TCEP）。 5mm的终浓度为1:100添加到样品。在37 ° 1小时
- 烷基化降低半胱氨酸。允许冷却到室温。做一个新鲜的等分1M碘乙酰胺。在黑暗中保持（我们管包装箔）。加入终浓度为20mm。在室温下1小时在黑暗中孵育。
- 淬火与1M股票在室温下1小时20mm的数码地面电视的碘乙酰胺
- 量化的一个标准布拉德福德或BCA法测定蛋白（没有说明）。采取下面的SDS - PAGE进行分析的样品。
- 为了验证注册成立的重同位素，使用100μL减少和烷基化裂解。 DH 2 O 1:4稀释，超声和胰蛋白酶的50:1蛋白质添加胰蛋白酶。消化至少4小时，干样品，然后用C18 Ultramicrospin列（鸟巢集团）VAC和淡化的速度下降。
- 水合物列100μL乙腈
- 与200μL0.1％TFA平衡。
- 重悬于200μL0.1％TFA的干样品。加载到列。离心〜200 XG或最小流量的速度需要通过列。
- 洗两次与200μL0.1％TFA。
- 洗脱与50μL60％的乙腈，0.1％TFA的两倍。
- 干样的速度VAC。
- 悬浮样品在20μL0.1％甲酸。运行2μL质谱仪。检查同位素重的精氨酸和赖氨酸10和8道尔顿的转变，在各自的m / z光谱法团。每个氨基酸纳入应在96 - 98％之间。
- 混合样品同位素重型和轻型等值金额（毫克的蛋白质）。
- 用20％甲醇稀释样品1:4。
- 添加胰蛋白酶1:200。过夜孵育在37 ° C。
- 检查SDS - PAGE，消化已经完成。运行2和4μL简化样品和8D 16μL后胰蛋白酶消化。考马斯染色的可视化，消化完全。如果它是不完整的的，用探针尖端sonicator简要超声样品，并再次用胰蛋白酶消化。
- 干燥的样品，在速度VAC。干燥时添加至沉淀成溶液200μL过滤生署2 O和旋涡。干样品下降速度VAC。再次重悬与DH 2 O。再次干样品。
- 悬浮颗粒0.1％Trifluoracetic乙酸（TFA;西格玛）。检查的pH值约为3，使用pH值条。如果需要的10％TFA酸化。
- 佩莱出任何沉淀。
- 一个水域SEP - PAK吸尘器500毫克C18柱脱盐样品。不要超负荷这些列。最高金额为5毫克，但它的更好的负载少一些。分成多个列之间如果有必要的样品。
- 水合物列5毫升100％乙腈。离心〜200 XG或最小流量的速度需要通过列。
- 用5ml 0.1％TFA平衡列。装入样品。收集流动和重新加载。
- 洗5毫升0.1％TFA。重复。
- 洗脱与2毫升60％乙腈，0.1％TFA的。
- 干样品下降速度VAC。
磷酸肽分馏和分离
- 肽是在HILIC列分割。我们使用TOSOH TSK - GEL酰胺 - 80 4.6毫米× 25厘米与保护柱分析柱。以你的时间，这一步在90％以上的运行2个小时的A列，然后运行两个空白梯度加载你的样品之前。在这种规模被认为是周围二十列的最大负载，我们通常不负载超过5毫克每运行。
- 溶剂A - 98％ACN/0.1％TFA
溶剂B - 2％ACN/0.1％TFA
负载超过20“，90％至85％，比5'，85％在90％到60％超过40”，60％，超过5 0％“，0％到90％ 5“。 - 流速为1ml/min，分数分别为85％至60％的梯度开始，每隔2分钟收集。
- 结合分数减少到10的分数。增加分数可能会带来更大的磷酸化的覆盖面。
富集磷酸化
- 磷酸丰富，采用磷酸选择铁亲和凝胶。我们等分IMAC树脂，以避免重复冷冻解冻。使250毫米醋酸，30％的乙腈负载溶液50毫升。用HCl使pH值至2.7。重悬浮颗粒负载的解决方案在500μL。检查pH值，用盐酸或氢氧化钠进行必要的调整。
- 预洗200μL的iMac珠在适当的列。我们使用Molbiotec的离心柱。
添加到每个分数的50％的泥浆（凝胶负载的解决方案）15μL，孵育30样本“，对年底旋转结束。保持流量进行分析。 - 洗净，与负载的解决方案样品3次，一次用500μL的过滤 生署 2 O
- 2 - 3分钟400 50毫米的Na 2 HPO 4（pH值8.4）缓冲液洗脱肽。转移到玻璃小瓶。
- 酸化至pH 3 5μL100％甲酸，闪光灯在液态氮冷冻，干燥样品速度VAC。
- 在200微升0.1％TFA和C18清洁如上所述，悬浮的磷酸化。干燥速度VAC洗脱样品。
- 重悬在20μL的0.1％甲酸肽。使用2μL每质谱仪分析，或根据需要。
注释
本议定书的大部分时间，你会被“瞎子”。细胞裂解液，可以监测免疫印迹和布拉德福德或BCA法检测，胰蛋白酶消化，还可以随时评估。 HILIC列了跟踪与此类似，或由其他[1，2]根据液相色谱机，用于见过。样品质谱监测; LCQs或之前，会在一个高的质量精度，高分辨率机高的成本分析MALDIs如廉价的机器上测试您的样品。最后，如果你干燥的样品与酸中，用玻璃。
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Discussion
这种方法将产生一个可定量分析的磷酸化的浓缩。在这个协议中许多参数可以改变，但要记住的最重要的方面是保护您的磷酸。定量细胞的制备，可在许多不同的方式实现，例如，如果你可以没有标签在体内，如作为ICAT标记你的细胞[3]或iTRAC工作[4]可以被使用后提取到不同的标签两种文化的量化目的。
最常见的方法进行分馏凝胶SDS - PAGE [5，6]分馏，SCX色谱法[7]，并基于HILIC色谱法[1，2]。我们选择HILIC，因为它保留，直到梯度结束肽，而在前面的梯度洗脱SCX但有其他团体与其他方法的良好成功。
当使用的iMac，您可能需要增加或减少树脂的使用量，培养时间或清洗。也有研究，寻找改变负载的解决方案，我们在座的[8]的初步化学。这相结合的方法，应允许60％至95％的磷酸化之间的样本，隔离。一旦你建立了一个适合您特定系统的方法，你应该能够磷酸化收益率更高的优化。
的磷酸化肽段的富集也可以实现与二氧化钛或亚磷化学[9，10] [11，12]，有研究表明，每个方法将产生重叠的磷酸化不同的部分[13] 。
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Acknowledgments
我们要感谢丰富的罗杰斯博士与质谱分析和有益的讨论，提供技术援助和Drs。罗布莫里茨，杰夫Ranish，哈米德有益的讨论Mirzai。
这项工作是由美国国立卫生研究院的卓越中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | |
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | |
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | |
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78420 | |
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | |
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | |
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | |
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | |
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | Tosoh Corp. | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | Tosoh Corp. | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
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