Summary
Descrizione di una procedura di fosforilazione quantitativa, utilizzando cryolysis, solubilziation urea, frazionamento HILIC e arricchimento IMAC di peptidi fosforilati.
Abstract
Questo protocollo descrive la crescita e la stimolazione, con l'oleato di acidi grassi, degli isotopi pesanti e leggeri cellule di S. cerevisiae. Le cellule sono a terra con un procedimento cryolysis in una smerigliatrice mulino a sfere e la conseguente grindate portato in soluzione mediante solubilizzazione urea. Questa procedura permette la lisi delle cellule in uno stato metabolicamente inattivo, conservando la fosforilazione e la prevenzione riorientamento della phosphoproteome durante la lisi cellulare. Dopo la riduzione, alchilazione, tripsina digestione delle proteine, i campioni sono dissalati su colonne C18 e la complessità del campione ridotto di frazionamento mediante cromatografia di interazione idrofilica (HILIC). Colonne HILIC preferenzialmente trattenere le molecole idrofile che ben si adatta per fosfoproteomica. Peptidi fosforilata tendono ad eluire successivamente nel profilo cromatografico che le controparti non fosforilata. Dopo frazionamento, fosfopeptidi sono arricchite usando la cromatografia in metallo immobilizzato, che si basa sulla carica a base di affinità per l'arricchimento fosfopeptide. Al termine di questa procedura i campioni sono pronti per essere analizzato quantitativamente mediante spettrometria di massa.
Protocol
La crescita delle cellule e dei media
- Una singola colonia di cellule BY4742Δarg4Δlys1 durante la notte in 100 ml di mezzi di comunicazione ricco di un OD 600 di 1,0 allora seme in due culture, 1 litro di un mezzo di lievito minimo (0,17% lievito di base di azoto, senza solfato di ammonio o amminoacidi, solfato di ammonio 0,5%) contenente un gamma completa di aminoacidi, integrata con 20 mg / L di arginina isotopi normale o pesante (13 C 6 15 N 4; Isotec) e lisina (13 C 6 15 N 2; Isotec).
- Le cellule sono state coltivate per 18 ore, ad un OD 600 del 1.8. E 'fondamentale che le cellule passano attraverso almeno 9 generazioni per raggiungere piena integrazione dei isotopi etichettati. Il campione luce era pellet, lavato con acqua sterile, reseeded in un oleato contenente medio (isotopicamente normale arginina e lisina, 0,2% Oleato (chimici Sigma) e 0,5% di Tween 40 (Sigma Chimica)) e stimolati per altri 85 minuti. Questo produce un isotopicamente luce, per quanto riguarda l'arginina e lisina, oleato stimolati campione e un isotopi pesanti di glucosio-cresciuto campione di riferimento.
Cellula Lysis, Isolamento e frazionamento dei peptidi
- Pesare bottiglia centrifuga. Raccolta di campioni mediante centrifugazione per 3 minuti. Rimuovere i supporti ed aspirare il liquido in eccesso. Pesare pellet e bottiglia (in genere di rendimento tra i 1-2 grammi) e poi congelare il flash in azoto liquido. Aggiungi un equivalente volume a peso pellet di tampone 'macinazione' per i pellet congelato in azoto liquido (tampone fosfato isotonico (PBS, Gibco), 10% glicerolo, inibitori della proteasi (SigmaFAST compresse inibitore della proteasi, Sigma) e gli inibitori della fosfatasi HALT (Thermo Scientific )).
- Congelare la nave macinazione in azoto liquido. Attendere che l'azoto liquido cessa bollente. Trasferire il pellet alla nave di rettifica, con cuscinetti a sfera congelata.
- Grind a 600 giri al minuto con un min 1 ciclo di 20 secondi con una inversione di direzione per 3 minuti. Ricongelare la nave macinazione in azoto liquido. Ripetere 4 volte per 15 minuti il tempo totale di macinazione.
- Raccogliere la grindate congelato in un luogo ghiaccio 50ml tubo Falcon asciutto. Conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Ottenere una soluzione 10 ml di urea 8M, bicarbonato di ammonio 0,1 M, 0,1 M Tris pH 8.6. Aggiungere 3 volumi del buffer di urea al 1 ° volume del grindate congelati (per esempio 3mls del buffer di urea aggiunto a un grammo 1 pellet con 1 ml di tampone PBS). Immediatamente sonicare la miscela con un sonicatore punta della sonda (2 - 10 impulsi al secondo). Tenere la punta vicino al fondo della provetta per evitare formazione di schiuma nella soluzione. Il grindate dovrebbe immediatamente andare in soluzione.
- Cancella il lisato per centrifugazione per 5 minuti a 4 ° C.
- Trasferire il supernatante in tubi di fresco.
- Fai una nuova aliquota di 0,5 M Tris [2-carbossietil] fosfina (TCEP). Aggiungi a campione a 1:100 per una concentrazione 5mM finale. Incubare a 37 ° C per 1 h.
- Alchilazione di cisteine ridotte. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Fai una nuova aliquota di Iodoacetamide 1M. Tenere al buio (ci avvolgere il tubo in alluminio). Aggiungere a una concentrazione finale di 20 mm. Incubare al buio per 1 ora a temperatura ambiente.
- Placare la Iodoacetamide con DTT 20 mM da uno stock 1M a temperatura ambiente per 1 h.
- Quantificare la proteina con una Bradford standard o BCA test (non descritto). Prelevare un campione per l'analisi di SDS PAGE seguito.
- Per convalidare l'incorporazione degli isotopi pesanti, usare 100 ml di lisato ridotto e alchilata. Diluire 1:4 con dH 2 O, ultrasuoni e aggiungere tripsina a 50:1 proteine tripsina. Digest per un minimo di 4 ore, campione secco giù in una velocità di vac e poi desalt con colonne Ultramicrospin C18 (il gruppo Nest).
- Idrato colonna con 100 ml di Acetonitrile
- Equilibrare con 200 microlitri TFA 0,1%.
- Risospendere campione secco in 200 microlitri TFA 0,1%. Caricare sulla colonna. Centrifugare a ~ 200 xg o la velocità minima necessaria per il flusso attraverso la colonna.
- Lavare due volte con 200 microlitri TFA 0,1%.
- Eluire con due volte con 50 microlitri Acetonitrile 60%, 0,1% TFA.
- Campione secco a una velocità di vac.
- Campione Risospendere in 20 microlitri di acido formico 0,1%. Run 2 microlitri su uno spettrometro di massa. Controllare l'incorporazione di arginina e lisina isotopi pesanti da uno spostamento 10 e 8 Dalton nelle rispettive m / z spettri. L'incorporazione di ogni amminoacido deve essere tra 96 - 98%.
- Mix importi equivalenti (mg di proteine) dei campioni isotopi pesanti e leggeri.
- Diluire il campione 1:4 con 20% di metanolo.
- Aggiungi tripsina a 1:200. Incubare per una notte a 37 ° C.
- Controllare che la digestione è andato a compimento da SDS PAGE. Run 2 e 4 ml di campione predigestione e 8 unod 16 microlitri della tripsina posta digerire. Visualizzate dalla colorazione Coomassie che la digestione è completa. Se non è completa, sonicare il campione con un breve sonicatore punta della sonda e digerire di nuovo con tripsina.
- Secco il campione giù in una velocità di vac. Quando aggiungete a secco 200 ml di filtrato dH 2 O e agitare fino a pellet va in soluzione. Campione secco giù in una velocità di vac. Risospendere di nuovo con dH 2 O. Campione secco di nuovo.
- Risospendere il pellet in 0,1% Acido Trifluoracetic (TFA, Sigma). Verificare che il pH è di circa 3 con strisce pH. Se necessario acidificare con il 10% TFA.
- Pellet qualsiasi precipitato.
- Desalificare i campioni su un set-Pak Waters Vac 500 mg colonna C18. Non sovraccaricare queste colonne. L'importo massimo è di 5 mg, ma è meglio caricare un po 'meno. Dividere il campione tra i più colonne, se necessario.
- Idratare la colonna con 5 ml di acetonitrile al 100%. Centrifugare a ~ 200 xg o la velocità minima necessaria per il flusso attraverso la colonna.
- Equilibrare colonna con 5ml TFA 0,1%. Carico del campione. Raccogliere il flusso e caricare di nuovo.
- Lavare con 5 ml di TFA 0,1%. Ripeti.
- Eluire con 2 ml Acetonitrile 60%, 0,1% TFA.
- Campione secco giù in una velocità di vac.
Frazionamento peptide e isolamento di fosfopeptidi
- Peptidi sono frazionati su una colonna HILIC. Usiamo un Tosoh TSK-Gel Amide-80 4,6 millimetri x 25 cm colonna analitica con una colonna di guardia. Prendete il vostro tempo con questo passaggio, eseguire la colonna per 2 ore a 90% A eseguire due gradienti vuoto prima di caricare il vostro campione. Il carico massimo su una colonna è pensato che questo formato da circa XX, di solito non caricare più di 5 mg per ciclo.
- Solvente A - 98% ACN/0.1% TFA
Solvente B - 2% ACN/0.1% TFA
Carico nel 90% A oltre 20 ', 90% A 85% A più di 5', 85% A 60% A più di 40 ', 60% A 0% A più di 5', 0% A 90% su A 5 '. - La portata è 1ml/min e le frazioni sono stati raccolti ad intervalli di 2 minuti dall'inizio al 85% A 60% Un gradiente.
- Combina frazioni di ridurre il numero di frazioni a 10. Frazioni aumentato probabilmente resa maggiore copertura del phosphoproteome.
Arricchimento del fosfopeptidi
- Fosfopeptidi sono arricchiti con PHOS-Select Gel Affinità di ferro. Noi la nostra aliquota resina IMAC per evitare congelamento ripetuto scongelamento. Fai 50 ml di acido acetico 250 mm, Soluzione al 30% del carico ACN. Portare il pH a 2,7 con HCl. Risospendere pellet in 500 ml di soluzione di carico. Controllare il pH, regolare con HCl o NaOH, se necessario.
- Prelavaggio 200 ml di perline IMAC in una colonna appropriata. Noi usiamo colonne di rotazione Molbiotec.
Aggiungere 15 ml di una sospensione al 50% (gel per caricare soluzione) per ogni frazione, e incubare i campioni per 30 'con il fine più di rotazione finale. Mantenere il flusso per l'analisi. - Lavare i campioni 3 volte con soluzione di carico e una volta con 500 microlitri filtrata dH 2 O.
- Peptidi eluire con 2 - 3 minuti con 400 ml di 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) buffer. Trasferire in un flaconcino di vetro.
- Acidificare a pH 3 con 5 microlitri di acido formico al 100%, il flash congelare in azoto liquido, e campione essiccato giù in una velocità di vac.
- Fosfopeptidi risospendere in 200 ml di 0,1% TFA e C18 pulito come descritto sopra. Secco giù campioni eluiti in una velocità vac.
- Risospendere peptidi in 20 microlitri di 0.1% di acido formico. Utilizzare 2 microlitri per analisi spettrometro di massa o, se necessario.
Note
Per gran parte di questo protocollo si dovrà lavorare 'cieco'. La lisi cellulare può essere monitorato da western blotting e saggi di Bradford e BCA, e la digestione tripsina può anche essere facilmente valutata. La colonna HILIC si diede una traccia simile a questa, o come visibile da altri [1, 2] a seconda della macchina cromatografia liquida che viene utilizzata. I campioni sono monitorati mediante spettrometria di massa, i campioni di prova su macchine poco costose come LCQs o MALDIs prima di andare in analisi dei costi in alto su una massa ad alta precisione, macchine ad alta risoluzione. Infine, se si un'asciugatura giù un campione con acido in essa, l'uso di vetro.
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Discussion
Questo metodo produrrà un arricchimento di fosfopeptidi che può essere analizzato quantitativamente. Un certo numero di parametri possono essere modificati in questo protocollo, ma l'aspetto più importante da ricordare è per preservare la vostra fosforilazione. Preparazione delle cellule per la quantificazione può essere ottenuto in molti modi diversi, ad esempio se non si possono etichettare le cellule in vivo, i tag come ICAT [3] o ITRAC [4] può essere utilizzato estrazione messaggio per etichettare in modo differenziato due culture per la quantificazione scopi.
Per il frazionamento dei metodi più comuni sono di frazionamento gel SDS PAGE [5, 6], SCX cromatografia [7], e HILIC base cromatografia [1, 2]. Abbiamo scelto HILIC perché mantiene i peptidi fino alla fine del gradiente, piuttosto eluizione nella parte anteriore del gradiente come in SCX ma altri gruppi hanno avuto un buon successo con altri metodi.
Quando si utilizza il IMAC potrebbe essere necessario aumentare o diminuire la quantità di resina utilizzata, il tempo di incubazione o il numero di lavaggi. Ci sono stati anche gli studi che ad alterare la chimica iniziale della soluzione di carico che vi presentiamo qui [8]. Questa combinazione di metodi dovrebbe permettere l'isolamento dei campioni che sono tra il 60% al 95% fosfopeptidi. Una volta stabilito un metodo per il sistema particolare si dovrebbe essere in grado di ottimizzare per una maggiore resa del fosfopeptidi.
Arricchimento del fosfopeptidi può essere ottenuta anche con TiO 2 [9, 10] o la chimica phosphoramidite [11, 12], e gli studi hanno indicato che ogni metodo produrrà sovrapponibili, ma porzioni distinte del phosphoproteome [13].
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott. Rogers Ricco di assistenza tecnica con analisi di spettrometria di massa e utili discussioni, e Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish, e Hamid Mirzai per utili discussioni.
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH Centri di Eccellenza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | |
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | |
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | |
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78420 | |
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | |
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | |
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | |
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | |
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | Tosoh Corp. | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | Tosoh Corp. | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
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