Summary
冷凍融解、尿素solubilziation、HILIC分画とリン酸化ペプチドのIMAC濃縮を用いた定量的リン酸化の手順の説明。
Abstract
このプロトコルは、同位体の重鎖および軽S.セレビシエ細胞の脂肪酸のオレイン酸、で、成長し、刺激を説明します。細胞は、ボールミルの粉砕機と尿素の可溶化により溶液に持ち込まれた結果grindateで冷凍融解の手順を使用して接地している。この手順では、リン酸化を維持し、細胞溶解中にリン酸化プロテオームの方向転換を防止する、代謝的に不活性状態で細胞の溶解が可能になります。還元、アルキル化、タンパク質のトリプシン消化後、サンプルをC18カラムと親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）を使用して分別削減サンプルの複雑さに脱塩されています。 HILICカラムには、優先的によくphosphoproteomicsに適した親水性の分子を保持する。リン酸化ペプチドは非リン酸化されたものよりクロマトグラフプロファイルは、後で溶出する傾向がある。分別した後、リン酸化ペプチドはリン酸化ペプチド濃縮用電荷ベースの親和性に依存している固定化金属クロマトグラフィーを、使用して濃縮される。この手順の最後にあるサンプルは、定量的質量分析法により分析する準備が整いました。
Protocol
細胞増殖とメディア
- その後、1.0のOD 600〜100mlリッチメディアで一晩BY4742Δarg4Δlys1細胞の単一コロニーを含む最小の酵母培地の二つ1リットルの培養（硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない0.17％酵母窒素塩基、0.5％硫酸アンモニウム）にシードとリジン（13 C 6 15 N 2、Isotec）、同位体的に正常または重いアルギニン（Isotec 13 C 6 15 N 4）の20mgの/ Lを添加したアミノ酸の充実した、。
- 細胞は1.8のOD 600に、18時間増殖させた。それは、細胞が標識された同位体の完全な取り込みを実現するために少なくとも9世代を経ることが重要です。光サンプルは、培地を（同位体、通常のアルギニンとリジン、0.2％オレイン酸（シグマケミカル）及び0.5％のTween 40（Sigma社化学））を含むオレイン酸に再シードし、別の85分のために刺激された、滅菌水で洗浄し、ペレット化した。これは、アルギニンやリジン、オレイン酸で刺激したサンプルと同位重いグルコース産の参照試料を基準にして、軽い同位得られます。
ペプチドの細胞の溶解、分離および分画
- 遠心ボトルを秤量する。 3分間の遠心分離により収穫のサンプル。メディアを取り出し、余分な液体を吸引除去する。ペレットとボトル（通常1〜2グラムの生成します）、液体窒素中で、フラッシュの凍結を量る。液体窒素で凍結ペレット（リン酸塩（PBS、Gibco）を緩衝生理食塩水、10％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤（SigmaFASTのプロテアーゼインヒビター錠、シグマ）の"粉砕"バッファのペレットの重量にボリュームと同等を追加し、ホスファターゼ阻害剤をHALT（サーモサイエンティフィック））。
- 液体窒素中で粉砕容器を凍結する。液体窒素が沸騰停止するまで待ちます。冷凍ボールベアリングで、粉砕容器にペレットを転送します。
- 3分間方向の反転で1分20秒のサイクルで、600rpmで挽く。液体窒素中で粉砕容器を再冷凍。合計粉砕時間15分4回繰り返します。
- 50ミリリットルファルコンチューブの代わりにドライアイスに冷凍grindateを収集する。使用を-80℃で保存するまで準備。
- 8M尿素、0.1Mの重炭酸アンモニウム、0.1MトリスpH 8.6の10mlのソリューションとなります。冷凍grindateの1ボリューム（尿素のバッファの例の3mls用PBS緩衝液1mlで1グラムペレットに添加）に尿素緩衝液の3倍量を追加。すぐに、プローブ先端の超音波処理（ - 10秒間のパルス2）との混合物を超音波で分解する。ソリューションの泡立ちを防ぐために、チューブの底近くに先端をキープ。 grindateは直ちにソリューションに行く必要があります。
- 4℃で5分間、遠心分離によってライセートをクリア℃に
- 新鮮なチューブに上清を移します。
- 0.5Mトリス[2 - カルボキシエチル]ホスフィン（TCEP）の新鮮なアリコートを行う。 5mMの最終濃度のために1:100でサンプルに追加。 37℃を1時間
- 削減システインのアルキル化。室温に冷却してください。 1Mヨードアセトアミドの新鮮なアリコートを行う。 （我々は箔で管を包む）暗所で保管してください。 20mmの最終濃度に追加します。室温で1時間、暗所でインキュベートする。
- 1時間室温で1M株式から20mm DTTとヨードアセトアミドを癒やす
- 標準ブラッドフォードまたはBCAアッセイ（記載されていない）を持つ蛋白質を定量化する。下のSDS PAGEによって分析用のサンプルを取る。
- 重い同位体の取り込みを検証するには、縮小およびアルキル化ライセート100μlを使用してください。のdH 2 Oで1:4に希釈して、超音波で分解し、トリプシンに50:1タンパク質でトリプシンを追加。 C18 Ultramicrospin列（ネストグループ）とVACし、脱塩速度のダウンは最低4時間、乾燥サンプルのダイジェスト。
- アセトニトリル100μlの水和物列
- 200μlの0.1％TFAで平衡化する。
- 200μlの0.1％TFAで乾燥したサンプルを再懸濁します。カラムにロードします。 〜200 XGまたは列内の流れのために必要な最小限の速度で遠心する。
- 200μlの0.1％TFAで2回洗浄。
- 50μlの60％アセトニトリル、0.1％TFAで二回で溶出。
- VACスピードで乾燥したサンプル。
- 20μlの0.1％ギ酸でサンプルを再懸濁します。質量分析計を2μlを実行します。それぞれm / zのスペクトル10と8ダルトンのシフトによって同位体重いアルギニンとリジンの取り込みを確認してください。 98パーセント - 各アミノ酸のための取り込みは、96の間でなければなりません。
- 同位体重いと光の試料の等量（タンパク質のmg）をミックス。
- 20％メタノールでサンプル1:4希釈する。
- 1:200でトリプシンを追加。 37℃で一晩インキュベート℃、
- その消化はSDS PAGEで完了するために行っているを確認してください。 2を実行し、前消化のサンプルの4μLおよび8後トリプシン消化物のdを16μlの。消化が完了したことをクマシー染色によって可視化する。それが完了していない場合、プローブ先端の超音波処理を短時間でサンプルを超音波で分解し、トリプシンで再びダイジェスト。
- VAC速度でサンプルを下に乾燥させる。乾燥したペレットを溶液になるまでフィルタリングのdH 2 Oと渦の200μlを追加すると。 VAC速度でサンプルを下に乾燥させる。のdH 2 Oで再懸濁します再度サンプルを乾燥させる。
- 0.1パーセントトリフルオロ酢酸でペレットを再懸濁します（TFA;シグマ）。 pHがストリップを用いて3程度であることを確認してください。 10％のTFAで酸性化する必要があれば。
- 沈殿物からペレット。
- ウォーターズをSep - Pak Vacを500mgのC18カラムでサンプルを脱塩。これらの列をオーバーロードしないでください。最大量は5 mgのですが、それは少し少なめにロードする方が良いでしょう。必要に応じて複数の列の間にサンプルを分割します。
- 水和物5ミリリットル、100％アセトニトリルでカラム。 〜200 XGまたは列内の流れのために必要な最小限の速度で遠心する。
- 5ミリリットルの0.1％TFAでカラムを平衡化する。サンプルをロードします。フローを収集し、再度ロードする。
- 5ミリリットルの0.1％TFAで洗浄する。繰り返します。
- 2ミリリットル60％アセトニトリル、0.1％TFAで溶出。
- VAC速度でサンプルを下に乾燥させる。
リン酸化ペプチドのペプチド分画と分離
- ペプチドは、HILICカラムで分画しています。我々は、東ソーTSK - GELアミド- 80 4.6ミリメートルX 25センチメートルガードカラムと分析カラムが使われています。このステップであなたの時間をかけ、次に実行する2つの空白の勾配は、サンプルをロードする前に、90％で2時間の列を実行します。このサイズはXXになるものと考えられている列の最大負荷は、我々は通常は実行ごとに5つ以上の投与をロードしないでください。
- 溶剤 - 98パーセントACN/0.1％TFA
溶媒B - 2％ACN/0.1％TFA
90％負荷以上20'、90％85％以上の5'、85％〜60％以上40'、60％0％から5以上"、0％〜90％以上5'。 - 流速は1ml/minであり、分画は85％〜60％の勾配で始まる2分間隔で収集した。
- 10のフラクションの数を減らすためにフラクションを組み合わせる。増加した分画は、おそらくリン酸化プロテオームの高いカバレッジを得られます。
リン酸化ペプチドの濃縮
- リン酸化ペプチドは、PHOS -セレクト鉄のアフィニティーゲルを用いて濃縮される。我々は、一定分量たちのIMAC樹脂を融解凍結を避けるために。 250mMの酢酸の50mlの、30％ACNの負荷のソリューションを行います。 HClでpH 2.7〜をもたらす。負荷溶液500μlにペレットを再懸濁します。必要に応じてHClまたはNaOHで調整し、pHを確認してください。
- 適切な列のIMACビーズの予備洗浄を200μl。我々はMolbiotecスピンカラムを使用してください。
各画分に50％のスラリー（ゲルソリューションをロードするため）の15μlを加え、そして最後の回転を介してエンドと30'のサンプルをインキュベートする。分析のための手順を守って下さい。 - 負荷液で試料を3回洗浄し、一回で500μlのフィルタリングのdH 2 Oを
- 2でペプチドを溶出- 50mMののNa 2 HPO 4（pHは8.4）緩衝液400μlの3分。ガラスバイアルに移す。
- 5μlの100％のギ酸、液体窒素中でフラッシュ凍結、およびVACスピードで乾燥試料ダウンでpH3に酸性化。
- 0.1％TFA、前述のようにきれいなC18の200μlに再懸濁し、リン酸化ペプチド。 VAC速度で溶出サンプルを乾燥させる。
- 0.1％ギ酸20μlにペプチドを再懸濁します。質量分析計の分析ごとに2μlを使用するか、または必要に応じて。
ノート
ずっとこのプロトコルのためには"ブラインド"働くことになります。細胞溶解は、ウェスタンブロットおよびブラッドフォードまたはBCAアッセイによって監視することができる、とトリプシン消化にも容易に評価することができます。 HILICカラムはこれに似たトレースを与えた、または他の[1、2]使用されている液体クロマトグラフィーのマシンに依存することによって見られるだろう。サンプルは、質量分析法によって監視され、そのような高質量精度、高解像度のマシン上で高コストの分析に行く前にLCQsまたはMALDIsなどの安価なマシン上でサンプルをテストします。あなたがそれに酸でサンプルをダウン乾燥最後に場合、ガラスを使用してください。
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Discussion
このメソッドは、定量的に分析することができるリン酸化ペプチドの濃縮が得られます。パラメータの数は、このプロトコルに変更が、覚えておくべき最も重要な側面は、リン酸化を維持することですすることができます。定量化のための細胞の調製はin vivoであなたの細胞を標識することができない場合など、さまざまな方法で達成することができる、などICATのようなタグ[3]またはITRAC [4]は差定量化のための二つの文化にラベルを付けるためにポスト抽出を使用することができます。目的。
分別のために最も一般的な方法は、SDS PAGE [5、6]、SCXクロマトグラフィー[7]、及びHILICベースのクロマトグラフィー[1、2]によってゲル分画です。我々は、それがグラデーションの終わりまで、ペプチドを保持するため、HILICを選んだのではなくSCXのように、勾配の前方に溶出するが、他のグループは他の方法との良好な成功を収めている。
IMACを使用する際には、洗浄の使用する樹脂の量、インキュベーションの時間あるいは数を増減する必要がある場合があります。また研究は、我々はここで[8]を提示するロードソリューションの初期の化学的性質を変えることで、そこに探している。このメソッドの組み合わせは、95％のリン酸化に60％の間にあるサンプルの分離を許可する必要があります。あなたが特定のシステムのための方法を確立したらあなたは、リン酸化ペプチドの高収率のためのことができる最適化するはずです。
リン酸化ペプチドの濃縮にも酸化チタンと[9、10]またはホスホルアミダイト化学[11、12]を達成することができます、との研究では、それぞれのメソッドはまだリン酸化プロテオーム[13]の別個の部分が重複もたらすことが示されている。
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Acknowledgments
我々は、技術的な質量分析の解析と有用な議論の支援、そして博士のために博士リッチロジャースに感謝したいと思います。ロブサンモリッツ、ジェフRanish、および有用な議論のためのハミドMirzai。
この作品は、優秀のNIHセンターによって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | |
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | |
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | |
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78420 | |
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | |
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | |
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | |
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | |
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | Tosoh Corp. | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | Tosoh Corp. | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
- Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
- McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
- Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
- Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
- Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
- Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
- Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
- Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
- Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
