Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية Published: October 12, 2009 doi: 10.3791/1474
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Systems Biology

Summary

وصف إجراء الفسفرة باستخدام كمية cryolysis ، solubilziation اليوريا ، وتجزيء HILIC تخصيب IMAC من الببتيدات فسفرته.

Abstract

يصف هذا البروتوكول في نمو والتحفيز ، مع أوليئات الأحماض الدهنية ، الثقيلة والخفيفة isotopically خلايا خميرة س. هي الأرض الخلايا باستخدام إجراء cryolysis في كرة مطحنة مطحنة وgrindate الناتجة جلبت الى حل عن طريق solubilization اليوريا. هذا الإجراء يسمح للتحلل الخلايا في دولة غير نشطة عملية الأيض ، والحفاظ على الفسفرة ومنع إعادة توجيه phosphoproteome أثناء تحلل الخلية. بعد التخفيض ، ألكلة ، تربسين هضم البروتينات ، والمحلاة العينات على أعمدة C18 وتعقيد العينة بنسبة تجزئة باستخدام ماء التفاعل اللوني (HILIC). أعمدة HILIC الاحتفاظ تفضيلي الجزيئات المائية التي هي مناسبة تماما لphosphoproteomics. الببتيدات فسفرته تميل إلى أزل في وقت لاحق ملف الكروماتوغرافي من نظرائهم من غير فسفرته. بعد التجزيء ، وأثرى به phosphopeptides يجمد اللوني المعادن ، الذي يعتمد على المسؤول القائم على الانتماءات لتخصيب phosphopeptide. في نهاية هذا الإجراء العينات مستعدون ليتم تحليلها كميا بواسطة مطياف الكتلة.

Protocol

نمو الخلايا وسائل الإعلام

  1. مستعمرة واحدة من خلايا BY4742Δarg4Δlys1 بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام 100 مل الغنية إلى OD 600 من البذور ثم 1.0 في الثقافات 1 ثنائية لتر من الخميرة المتوسطة الحد الأدنى (0.17 ٪ النيتروجين الخميرة قاعدة دون سلفات الأمونيوم أو الأحماض الأمينية ، و 0.5 ٪ كبريتات الامونيوم) تحتوي على كاملة مكملة من الأحماض الأمينية ، وتستكمل مع L / 20mg من أرجينين isotopically العادي أو الثقيل (13 C N 4 6 15 ؛ Isotec) ويسين (13 6 15 C N 2 ؛ Isotec).
  2. ونمت الخلايا لمدة 18 ساعة ، إلى 600 من OD 1.8. فمن الأهمية بمكان أن تذهب من خلال خلايا لا يقل عن 9 الأجيال لتحقيق الإدماج الكامل للنظائر المسمى. كانت العينة ضوء مكعبات ، وغسلها بالماء المعقم ، reseeded الى أوليئات تحتوي على المتوسط ​​(أرجينين العادي isotopically ويسين ، أوليئات 0.2 ٪ (كيماويات سيغما) و 0.5 ٪ توين 40 (سيغما كيماويات)) ، وحفز لمدة دقيقة 85. غلة هذا الضوء isotopically ، فيما يتعلق أرجينين ويسين ، أوليئات - حفز عينة والثقيلة isotopically عينة مرجعية الغلوكوز نمت.

تحلل الخلية ، وعزل والتقطير من الببتيدات

  1. وزن زجاجة الطرد المركزي. عينات الحصاد بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق. إزالة وسائل الإعلام ونضح السوائل الزائدة. وزن بيليه وزجاجة (لن تسفر عادة بين 1-2 جرام) ثم تجميد فلاش في النيتروجين السائل. إضافة إلى ما يعادل حجم الوزن من بيليه العازلة "طحن" في كريات مجمدة في النيتروجين السائل (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة (PBS ، Gibco) ، و 10 ٪ الجلسرين ، مثبطات الأنزيم البروتيني (أقراص SigmaFAST المانع البروتياز ، سيجما) ووقف مثبطات الفوسفاتيز (الحرارية العلمية )).
  2. تجميد السفينة طاحنة في النيتروجين السائل. انتظر حتى يتوقف غليان النيتروجين السائل. بيليه نقل إلى وعاء الطحن ، مع الكرات المجمدة.
  3. طحن في 600 دورة في الدقيقة مع حلقة 20 دقيقة 1 ثانية مع عكس الاتجاه لمدة 3 دقائق. اعادة تجميد السفينة طاحنة في النيتروجين السائل. كرر 4 مرات أكثر لمدة 15 دقيقة مجموع الوقت طحن.
  4. جمع grindate مجمدة في الجليد فالكون 50ml أنبوب مكان جاف. المحل في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
  5. جعل الحل 10ML من اليوريا 8M ، 0.1M بيكربونات الأمونيوم ، ودرجة الحموضة 8.6 0.1M تريس. إضافة 3 مجلدات من اليوريا إلى 1 العازلة حجم grindate المجمدة (على سبيل المثال من 3mls العازلة اليوريا واضاف بيليه إلى 1 غرام مع 1 مل من العازلة PBS). يصوتن الخليط على الفور مع لجنة التحقيق sonicator غيض (2-10 البقول الثانية). الحفاظ على الحافة بالقرب من الجزء السفلي من أنبوب لمنع الرغوة من الحل. يجب أن تذهب فورا إلى grindate الحل.
  6. مسح lysate بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  7. طاف لأنابيب نقل جديدة.
  8. جعل قسامة جديدة من تريس 0.5M [2 - carboxyethyl] الفوسفين (TCEP). إضافة إلى نموذج 1:100 في لتركيز نهائي 5mM. احتضان في 37 ساعة : 1 درجة مئوية
  9. ألكلة من cysteines مخفضة. السماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. جعل قسامة جديدة من iodoacetamide 1M. نضع في الظلام (ونحن التفاف أنبوب في احباط). إضافة إلى التركيز النهائي لل20mM. احتضان في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. إخماد iodoacetamide مع DTT 20mM من الأسهم 1M في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  11. تحديد كمية البروتين مع برادفورد القياسية أو مقايسة BCA (لا توصف). أخذ عينة لتحليلها بواسطة SDS PAGE أدناه.
  12. للتحقق من صحة إدراج النظائر الثقيلة ، واستخدام 100 ميكرولتر من lysate مخفضة والألكيلية. 01:04 تمييع مع DH 2 O ، وإضافة التربسين يصوتن في 50:1 البروتين لالتربسين. هضم لمدة لا تقل عن 4 ساعات ، العينة الجافة بانخفاض في السرعة وبطالة desalt ثم مع الأعمدة Ultramicrospin C18 (الفريق عش).
    1. هيدرات العمود مع 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل
    2. تتوازن مع TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪.
    3. Resuspend العينة الجافة في TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪. تحميل على العمود. الطرد المركزي في XG 200 ~ أو أدنى من سرعة المطلوبة للتدفق من خلال العمود.
    4. تغسل مرتين مع TFA ميكرولتر 200 بنسبة 0.1 ٪.
    5. أزل مع مرتين مع الأسيتونيتريل ميكرولتر 50 60 ٪ ، TFA 0.1 ٪.
    6. العينة الجافة في سرعة بطالة.
    7. Resuspend في 20 عينة حمض الفورميك ميكرولتر 0.1 ٪. تشغيل 2 ميكرولتر على مطياف الكتلة. الاختيار إدراج أرجينين الثقيلة وisotopically يسين بتحول دالتون 10 و 8 في أطياف م / ض منهما. وينبغي إدراج كل من الأحماض الأمينية تكون بين 96 -- 98 ٪.
  13. مزيج المبالغ المعادلة (ملغ من البروتين) من عينات isotopically الثقيلة والخفيفة.
  14. تمييع 01:04 العينة مع الميثانول 20 ٪.
  15. إضافة التربسين في 1:200. يحضن بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  16. تأكد من أن عملية الهضم قد ذهب إلى إنجاز SDS PAGE. تشغيل 2 و 4 ميكرولتر من العينة التهضيم و 8 anد 16 ميكرولتر للهضم التربسين آخر. تصور من قبل تلطيخ Coomassie أن اكتمال عملية الهضم. إذا لم تكن كاملة ، يصوتن العينة لفترة وجيزة مع sonicator غيض التحقيق مرة أخرى مع وهضم التربسين.
  17. تجفيف عينة عليها في سرعة بطالة. عند إضافة الجافة 200 ميكرولتر من تصفيتها O 2 درهم ودوامة حتى بيليه يذهب الى حل. عينة أسفل الجافة في سرعة بطالة. Resuspend مرة أخرى مع DH 2 O. جفاف العينة مرة أخرى.
  18. Resuspend بيليه في حمض Trifluoracetic 0.1 ٪ (TFA ؛ سيغما). تأكد من أن الرقم الهيدروجيني حوالي 3 باستخدام شرائح الأس الهيدروجيني. إذا لزم الأمر مع يحمض TFA 10 ٪.
  19. بيليه خارج أي راسب.
  20. Desalt العينات على مياه سبتمبر الباكستانية بطالة العمود C18 500 ملغ. لا الزائد هذه الأعمدة. المبلغ الأقصى هو 5 مغ لكنه أفضل قليلا لتحميل أقل. تقسيم العينة بين عدة أعمدة إذا لزم الأمر.
    1. هيدرات العمود مع أسيتونتريل 5 مل 100 ٪. الطرد المركزي في XG 200 ~ أو أدنى من سرعة المطلوبة للتدفق من خلال العمود.
    2. يوازن العمود مع 5ml TFA 0.1 ٪. تحميل العينة. تدفق جمع وتحميل مرة أخرى.
    3. يغسل مع TFA 5 مل 0.1 ٪. تكرار.
    4. أزل مع 2ml الأسيتونيتريل 60 ٪ ، TFA 0.1 ٪.
    5. عينة أسفل الجافة في سرعة بطالة.

الببتيد التقطير وعزل Phosphopeptides

  1. الببتيدات هي مجزأة على عمود HILIC. نستخدم TOSOH TSK - جل الأميد 4.6 - 80 مم × 25 سم عمود التحليلية مع عمود الحراسة. خذ وقتك مع هذه الخطوة ، تشغيل العمود لمدة 2 ساعة على 90 ٪ وتشغيل ثم اثنين التدرجات فارغة قبل التحميل عينتك. الحمل الأقصى على عمود ويعتقد أن هذا الحجم إلى حوالي العشرين ، ونحن عادة لا يتم تحميلها أكثر من 5 ملغ في التشغيل.
  2. مذيب أ -- 98 ٪ ACN/0.1 ٪ TFA
    المذيب ب -- 2 ٪ ACN/0.1 ٪ TFA
    تحميل في 90 ٪ أكثر من 20 ألف ، 90 ٪ إلى 85 ٪ وهناك ما يزيد على 5 ، 85 ٪ إلى 60 ٪ وأكثر من 40 ألف ، 60 ٪ من ألف إلى 0 ٪ وأكثر من 5 ، 0 ٪ إلى 90 ٪ وأكثر من ألف 5 '.
  3. معدل التدفق 1ml/min وجمعت الكسور في فترات دقيقة 2 ابتداء من 85 ٪ إلى 60 ٪ والتدرج.
  4. الجمع بين الكسور للحد من عدد من الكسور إلى 10. وسيؤدي على الارجح الى زيادة كسور أكبر تغطية phosphoproteome.

إثراء phosphopeptides

  1. يتم إثراء Phosphopeptides به مؤسسات الصحة الأولية لاختيار جل تقارب الحديدي. نحن لدينا راتنج قسامة IMAC لتجنب تكرار تجميد الذوبان. جعل 50 ملل من حمض الخليك 250 ملم ، و 30 ٪ الحل تحميل ACN. إحضار الرقم الهيدروجيني إلى 2.7 مع حمض الهيدروكلوريك. Resuspend الكريات في 500 ميكرو لتر من محلول يتم تحميلها. فحص الحموضة ، وضبط مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو حسب الضرورة.
  2. Prewash 200 ميكرولتر من الخرز IMAC في العمود المناسب. علينا استخدام الأعمدة تدور Molbiotec.
    إضافة 15 ميكروليتر من الطين 50 ٪ (هلام لتحميل الحل) إلى كل جزء ، واحتضان نماذج لمدة 30 "مع نهاية التناوب على النهاية. الحفاظ على تدفق للتحليل.
  3. غسل العينات 3 مرات مع الحل تحميل ومرة واحدة مع 500 ميكرولتر تصفيتها درهم 2 O.
  4. أزل الببتيدات مع 2 -- 3 دقائق مع 400 ميكرولتر من 50 ملي نا 2 هبو 4 (8.4 درجة الحموضة) العازلة. نقل إلى قارورة زجاجية.
  5. تحمض إلى درجة الحموضة 3 مع 5 ميكرولتر حمض الفورميك بنسبة 100 ٪ ، ومضة التجميد في النيتروجين السائل والمجفف عينة عليها في سرعة بطالة.
  6. Resuspend phosphopeptides في 200 ميكرولتر من TFA 0.1 ٪ و C18 نظيفة كما هو موضح أعلاه. أسفل عينات eluted الجافة في سرعة بطالة.
  7. Resuspend الببتيدات في 20 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪. 2 ميكرولتر استخدام مطياف الكتلة في التحليل أو حسب الحاجة.

تلاحظ

لجزء كبير من هذا البروتوكول سوف تعمل 'الأعمى'. ويمكن رصد تحلل الخلية النشاف الغربية والمقايسات برادفورد أو BCA ، ويمكن أيضا أن تكون عملية الهضم التربسين المقررة بسهولة. سوف العمود HILIC أعطى تتبع مشابهة لهذه واحدة ، أو كما يراها الآخرون [1 ، 2] اعتمادا على آلة اللوني السائل الذي يتم استخدامه. ويتم رصد العينات بواسطة مطياف الكتلة ، واختبار العينات الخاصة بك على الأجهزة غير مكلفة مثل LCQs MALDIs أو قبل الذهاب إلى تحليلات التكلفة العالية على دقة عالية الشامل ، وارتفاع آلة القرار. أخيرا إذا كان لك وتجفيف بانخفاض عينة مع حمض فيه ، واستخدام الزجاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهذه الطريقة تؤدي الى تخصيب phosphopeptides التي يمكن تحليلها كميا. ويمكن تغيير عدد من المعلمات في هذا البروتوكول ، ولكن الجانب الأكثر أهمية هو أن نتذكر للحفاظ على الفسفرة الخاص. لا يمكن أن يتحقق إعداد الخلايا لالكمي في عدد من طرق مختلفة ، على سبيل المثال اذا كنت لا تستطيع تسمية الخلايا الخاصة بك في العلامات ، فيفو مثل ICAT [3] أو ITRAC [4] ويمكن استخدام استخراج آخر لتسمية تفاضليا ثقافتين لالكمي الأغراض.

لتجزيء الأساليب الأكثر شيوعا هي التي تجزيء جل SDS PAGE [5 ، 6] ، SCX اللوني [7] ، ومقرها اللوني HILIC [1 ، 2]. اخترنا HILIC لأنه يحتفظ الببتيدات حتى نهاية التدرج ، يبلغ حجمه بل في الجزء الأمامي من الانحدار كما هو الحال في SCX لكن الجماعات الأخرى قد حققت نجاحا جيدا مع أساليب أخرى.

عند استخدام IMAC قد تحتاج إلى زيادة أو نقصان كمية من الراتنج المستخدم ، والوقت من الحضانة أو عدد من يغسل. كانت هناك أيضا دراسات تبحث في تغيير كيمياء الأولي من الحل تحميل أن نقدم هنا [8]. وينبغي لهذه التوليفة من الأساليب السماح للعزلة من العينات التي تتراوح بين 60 ٪ إلى 95 ٪ phosphopeptides. وبمجرد الانتهاء من وضع طريقة لنظام التشغيل الخاصة بك يجب أن تكون قادرة على تعظيم العائد من أعلى phosphopeptides.

ويمكن أيضا إثراء phosphopeptides أن يتحقق مع تيو 2 [9 ، 10] أو phosphoramidite الكيمياء [11 ، 12] ، وأشارت الدراسات إلى أن كل أسلوب سوف تسفر حتى الآن تداخل أجزاء مختلفة من phosphoproteome [13].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتور ريتش روجرز للحصول على المساعدة الفنية مع تحليلات ومناقشات مطياف الكتلة مفيدة ، والدكاترة. سرقة موريتز ، Ranish جيف ، وحميد Mirzai لإجراء مناقشات مفيدة.

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومراكز للتميز.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 Sigma-Aldrich 608033
Isotec™ L-Lysine-15N2 Sigma-Aldrich 609021
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid Invitrogen 70011044
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific, Inc. 78420
Retsch PM100 Ball Mill Grinder Retsch 20.540.0001
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar Retsch 01.462.0148
Ultramicrospin C18 column The Nest Group SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18 Waters WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column Tosoh Corp. 13071 This is the HILIC chromatographic column.
Guard column 4.6 mm ID x1 cm Tosoh Corp. 19021 We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel Sigma-Aldrich P9740 This is the IMAC resin. Aliquot and store.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
  2. McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
  3. Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
  6. Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
  7. Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
  8. Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
  9. Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  10. Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  11. Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
  12. Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
  13. Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).

Tags

البيولوجيا الخلوية ، العدد 32 ، الفسفرة ، البروتيوميات ، Cryolysis ، الخميرة ، HILIC ، IMAC ، أوليئات ، SILAC
حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية<em> السكيراء الجعوية</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleem, R. A., Aitchison, J. D.… More

Saleem, R. A., Aitchison, J. D. Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (32), e1474, doi:10.3791/1474 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter