Summary
Beschrijving van een kwantitatieve fosforylering procedure met behulp van cryolysis, ureum solubilziation, HILIC fractionering en IMAC verrijking van gefosforyleerde peptiden.
Abstract
Dit protocol beschrijft de groei en stimuleren, met het vetzuur oleaat, van isotopisch zware en lichte S. cerevisiae cellen. Cellen worden gemalen met behulp van een cryolysis procedure in een kogelmolen molen en de daaruit voortvloeiende grindate gebracht oplossing van ureum oplosbaar. Deze procedure maakt het mogelijk om lysis van de cellen in een metabool inactieve toestand, met behoud van fosforylatie en het voorkomen van heroriëntatie van de phosphoproteome tijdens de cel lysis. Na de reductie, alkylering, trypsine vertering van de eiwitten, worden de monsters ontzout op C18 kolommen en het monster complexiteit verminderd door fractionering met hydrofiele interactie chromatografie (HILIC). HILIC kolommen bij voorkeur behouden hydrofiele moleculen die goed geschikt is voor phosphoproteomics. Gefosforyleerde peptiden hebben de neiging om later elueren in de chromatografische profiel dan de niet gefosforyleerde tegenhangers. Na fractionering, zijn fosfopeptiden verrijkt met behulp van geïmmobiliseerde metalen chromatografie, die zich baseert op lading op basis van affiniteit voor Phosphopeptide verrijking. Aan het einde van deze procedure de monsters zijn klaar om kwantitatief worden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie.
Protocol
Celgroei en media
- Een enkele kolonie van BY4742Δarg4Δlys1 cellen 's nachts in 100 ml rijke media om een OD 600 van 1,0 dan zaad in twee 1 liter culturen van een minimale gist medium (0,17% yeast nitrogen base, zonder ammoniumsulfaat of aminozuren, 0,5% ammonium sulfaat) met een volledige aanvulling van aminozuren, aangevuld met 20 mg / L van isotopisch normale of zware arginine (13 C 6 15 N 4, Isotec) en lysine (13 C 6 15 N 2; Isotec).
- De cellen werden gekweekt gedurende 18 uur, tot een OD 600 van 1,8. Het is cruciaal dat de cellen gaan door minstens 9 generaties volledige opname van de gelabelde isotopen te bereiken. Het licht monster werd gepelleteerd, gewassen met steriel water, reseeded in een oleaat bevattend medium (isotopisch normale arginine en lysine, 0,2% oleaat (Sigma Chemicals) en 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) en gestimuleerd nog eens 85 minuten. Dit levert een isotopisch licht, met betrekking tot arginine en lysine, oleaat-gestimuleerde monster en een isotopisch zware glucose-grown referentiemonster.
Cell Lysis, isolatie en fractionering van peptiden
- Weeg centrifuge fles. Oogst monsters door middel van centrifugeren gedurende 3 minuten. Verwijder de media en zuig overtollige vloeistof. Weeg pellet en een fles (zal typisch opbrengst tussen de 1-2 gram), dan knipperen vriezen in vloeibare stikstof. Voeg een volume dat overeenkomt met het gewicht van de pellet 'slijpen' buffer om de bevroren pellets in vloeibare stikstof (fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, Gibco), 10% glycerol, proteaseremmers (SigmaFast proteaseremmer Tabletten, Sigma) en HALT fosfatase-remmers (Thermo Scientific )).
- Freeze het slijpen schip in vloeibare stikstof. Wacht tot de vloeibare stikstof ophoudt koken. Breng de pellet aan het malen vaartuig, met bevroren kogellagers.
- Grind bij 600 rpm met een 1 min 20 sec cyclus met een richting omkering gedurende 3 minuten. Opnieuw invriezen het slijpen schip in vloeibare stikstof. Herhaal dit vier keer gedurende 15 minuten in totaal slijpen tijd.
- Verzamel de bevroren grindate in een 50 ml Falcon buis plaatsen droog ijs. Bewaren bij -80 ° C tot klaar voor gebruik.
- Maak een oplossing van 10 ml 8M ureum, 0,1 M ammoniumbicarbonaat, 0,1 M Tris pH 8,6. Voeg drie volumes van de ureum buffer tot een volume van het bevroren grindate (bijvoorbeeld 3mls van het ureum buffer toegevoegd aan een 1 gram pellet met 1 ml PBS buffer). Onmiddellijk ultrasone trillingen het mengsel met een sonde ultrasoonapparaat (2 - 10 seconden pulsen). Houd de tip de buurt van de bodem van de buis om te voorkomen dat schuimvorming van de oplossing. De grindate moet onmiddellijk in oplossing gaan.
- Schakel het lysaat door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Overdracht supernatant in de frisse buizen.
- Maak een verse hoeveelheid van 0,5 M Tris [2-carboxyethyl] fosfine (TCEP). Voeg toe aan monster op 1:100 voor een 5mm uiteindelijke concentratie. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur
- Alkylering van verminderde cysteines. Laat afkoelen tot kamertemperatuur. Maak een verse hoeveelheid van 1M joodacetamide. Houden in het donker (we de buis wikkelen in folie). Voeg toe aan een uiteindelijke concentratie van 20 mm. Incubeer in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Quench de joodacetamide met 20mm DTT van een 1M voorraad bij kamertemperatuur gedurende 1 uur
- Kwantificeren van het eiwit met een standaard Bradford of BCA assay (niet beschreven). Neem een monster voor analyse door middel van SDS PAGE hieronder.
- Te valideren incorporatie van de zware isotopen, gebruik 100 ul van de gereduceerde en gealkyleerde lysaat. Verdunnen 1:4 met dH 2 O, ultrasone trillingen en voeg trypsine op 50:1 eiwit trypsine. Digest voor een minimum van 4 uur, droge monster in een Speed Vac en daarna ontzouten met een C18 Ultramicrospin de kolommen (The Nest Group).
- Hydrate kolom met 100 ul van acetonitril
- Equilibreren met 200 ul 0,1% TFA.
- Resuspendeer droge monster in 200 ul 0,1% TFA. Belasting op kolom. Centrifugeer op 200 xg ~ of de minimale snelheid die nodig is voor stroming door de kolom.
- Was tweemaal met 200 ul 0,1% TFA.
- Twee keer elueren met met 50 ul 60% acetonitril, 0,1% TFA.
- Monster in een Speed Vac.
- Resuspendeer monster in 20 ul 0,1% mierenzuur. Run 2 ui op een massa-spectrometer. Controleer integratie van isotopisch zware arginine en lysine door een 10 en 8 Dalton verschuiving in de respectieve m / z spectra. De opname voor elk aminozuur moet tussen 96 - 98%.
- Meng gelijke hoeveelheden (mg van eiwitten) van de isotopisch zware en lichte monsters.
- Verdunnen sample 01:04 met 20% methanol.
- Voeg trypsine op 1:200. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Controleer of de spijsvertering is gegaan tot voltooiing door middel van SDS PAGE. Run 2 en 4 pl van de predigestion monster en 8 eend 16 ul van de post trypsine verteren. Visualiseren door Coomassie kleuring die de spijsvertering is voltooid. Als het niet compleet is, ultrasone trillingen van het monster met een sonde ultrasoonapparaat kort en te verteren weer met trypsine.
- Droog het monster in een Speed Vac. Bij het droog 200 ul van gefilterd dH 2 O en vortex toe te voegen tot de pellet in oplossing gaat. Droog monster in een Speed Vac. Resuspendeer wederom met dH 2 O. Weer droog monster.
- Resuspendeer pellet in 0,1% trifluorazijnzuur (TFA, Sigma). Controleer of de pH-waarde is ongeveer 3 met behulp van pH-strips. Als zuur nodig met 10% TFA.
- Pellet van de oplossing.
- Ontzouten van de monsters op een Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18 kolom. Niet overbelasten deze kolommen. Het maximale bedrag is 5 mg maar het is beter te laden iets minder. Verdeel het monster over meerdere kolommen indien nodig.
- Hydrateren de kolom met 5 ml 100% acetonitril. Centrifugeer op 200 xg ~ of de minimale snelheid die nodig is voor stroming door de kolom.
- Evenwicht kolom met 5 ml 0,1% TFA. Belasting monster. Verzamel stroom en laad het opnieuw.
- Wassen met 5 ml 0,1% TFA. Herhalen.
- Elueren met 2ml 60% acetonitril, 0,1% TFA.
- Droog monster in een Speed Vac.
Peptide Fractionering en isolatie van fosfopeptiden
- Peptiden zijn gefractioneerd op een HILIC kolom. We maken gebruik van een Tosoh TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm analytische kolom met een bewaker kolom. Neem de tijd met deze stap, voert de kolom gedurende 2 uur bij 90% A voert u twee lege hellingen voordat u uw monster. De maximale belasting op een column van deze grootte wordt gedacht dat ongeveer XX, we meestal niet belasting meer dan 5 mg per run.
- Oplosmiddel A - 98% ACN/0.1% TFA
Oplosmiddel B - 2% ACN/0.1% TFA
Belasting in 90% A meer dan 20 ', 90% A tot 85% A meer dan 5', 85% A tot 60% A meer dan 40 ', 60% A tot 0% A meer dan 5', 0% A tot 90% A over 5 '. - Het debiet is 1ml/min en fracties werden verzameld op 2 minuten met intervallen te beginnen bij de 85% A tot 60% A verloop.
- Combineer fracties om het aantal fracties te verminderen tot 10. Verhoogde fracties zullen waarschijnlijk opleveren grotere dekking van de phosphoproteome.
Verrijking van fosfopeptiden
- Fosfopeptiden zijn verrijkt met behulp van PHOS-Select Iron Affiniteit Gel. We aliquot onze IMAC hars om te voorkomen dat herhaalde vries ontdooien. Maak 50 ml van een 250 mM azijnzuur, 30% ACN belasting oplossing. Breng de pH op 2.7 met HCl. Resuspendeer pellets in 500 pi van de belasting-oplossing. Controleer de pH, aan te passen met HCl of NaOH als dat nodig is.
- Voorwas 200 ul van IMAC kralen in een passende kolom. We maken gebruik van Molbiotec spin-kolommen.
Voeg 15 ul van een 50% slurry (gel om de oplossing te laden) aan elke fractie, en incubeer de monsters voor 30 'met een eind over eind rotatie. Houd de stroom voor analyse. - Was de monsters 3 keer met last-oplossing en een keer met 500 ul gefilterd dH 2 O.
- Elueer peptiden met 2 - 3 min met 400 ul van 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) buffer. Transfer naar een glazen flacon.
- Verzuren tot pH 3 met 5 pi 100% mierenzuur, flash bevriezen in vloeibare stikstof, en gedroogde monster in een Speed Vac.
- Resuspendeer fosfopeptiden in 200 pi van 0,1% TFA en C18 schoon als hierboven beschreven. Droog naar beneden geëlueerd monsters in een Speed Vac.
- Resuspendeer peptiden in 20 pl van 0,1% mierenzuur. Gebruik 2 pi per massa-spectrometer analyse of als dat nodig is.
Opmerkingen
Voor veel van dit protocol dat u zult werken 'blind'. De cel lysis kan worden gecontroleerd door western blotting en Bradford of BCA testen, en de trypsine spijsvertering kan ook gemakkelijk worden beoordeeld. De HILIC kolom gaf een trace vergelijkbaar met deze, of zoals door anderen gezien [1, 2] afhankelijk van de vloeistofchromatografie machine die wordt gebruikt. Monsters worden gecontroleerd door massa-spectrometrie, test je samples op goedkope machines, zoals LCQs of MALDIs voordat je naar de hoge kosten analyses op een hoge nauwkeurigheid van massa's, hoge resolutie machine. Tenslotte, indien u een droging in een monster met een zuur in, gebruik dan glas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode levert een verrijking van fosfopeptiden die kwantitatief kunnen worden geanalyseerd. Een aantal parameters kunnen worden gewijzigd in dit protocol, maar het belangrijkste aspect om te onthouden is om het behoud van uw fosforylatie. Voorbereiding van de cellen voor de kwantificering kan worden bereikt in een aantal verschillende manieren, bijvoorbeeld als je niet kunt uw cellen label in vivo, tags zoals ICAT [3] of ITRAC [4] kan gebruikt worden na de winning tot differentieel label twee culturen voor de kwantificering doeleinden.
Voor de fractionering van de meest voorkomende methoden zijn gel fractionering door SDS PAGE [5, 6], SCX chromatografie [7], en HILIC op basis van chromatografie [1, 2]. We kozen HILIC omdat het behoudt de peptiden tot het einde van het verloop, in plaats van eluerende aan de voorzijde van het verloop als in SCX, maar andere groepen hebben goede succes met andere methoden.
Bij gebruik van de IMAC kan het nodig te verhogen of verlagen van de hoeveelheid hars wordt gebruikt, de tijd van incubatie of het aantal wasbeurten. Er zijn ook studies te kijken naar het veranderen van de eerste chemische samenstelling van de lading oplossing die we hier presenteren [8]. Deze combinatie van methoden moet het mogelijk maken het isolement van de monsters die tussen de 60% tot 95% fosfopeptiden. Als je eenmaal hebben een methode voor uw specifieke systeem moet u in staat te optimaliseren voor een hogere opbrengst van fosfopeptiden worden.
Verrijking van fosfopeptiden kan ook worden bereikt met TiO 2 [9, 10] of fosforamidiet chemie [11, 12], en studies hebben aangetoond dat elke methode zal nog bepaalde gedeelten van het phosphoproteome opbrengst overlappende [13].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Dr Rich Rogers bedanken voor technische bijstand met massaspectrometrie analyses en behulpzaam discussies en Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish, en Hamid Mirzai voor nuttige discussies.
Dit werk werd gefinancierd door de NIH Centers of Excellence.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | |
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | |
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | |
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78420 | |
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | |
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | |
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | |
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | |
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | Tosoh Corp. | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | Tosoh Corp. | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
- Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
- McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
- Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
- Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
- Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
- Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
- Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
- Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
- Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
