Summary
Description d'une procédure de phosphorylation quantitative à l'aide cryolysis, solubilziation urée, de fractionnement et l'enrichissement HILIC IMAC de peptides phosphorylés.
Abstract
Ce protocole décrit la croissance et la stimulation, avec l'oléate d'acides gras, des isotopes lourds et légers cellules de S. cerevisiae. Les cellules sont broyées à l'aide d'une procédure cryolysis dans un moulin broyeur à boulets et les grindate résultant mis en solution par solubilisation d'urée. Cette procédure permet la lyse des cellules dans un état métaboliquement inactives, la préservation de la phosphorylation et la prévention de la réorientation de l'phosphoprotéome lors de la lyse cellulaire. Après la réduction, l'alkylation, digestion par la trypsine des protéines, les échantillons sont dessalés sur des colonnes C18 et la complexité de l'échantillon réduit de fractionnement par chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC). Colonnes HILIC retiennent préférentiellement des molécules hydrophiles qui est bien adapté pour phosphoprotéomique. Peptides phosphorylés ont tendance à éluer plus tard dans le profil chromatographique que leurs homologues non phosphorylées. Après fractionnement, phosphopeptides sont enrichis en utilisant la chromatographie en métal immobilisé, qui repose sur la charge basé sur des affinités pour l'enrichissement phosphopeptide. A la fin de cette procédure, les échantillons sont prêtes à être analysées quantitativement par spectrométrie de masse.
Protocol
La croissance cellulaire et les médias
- Une seule colonie de cellules BY4742Δarg4Δlys1 nuit dans 100 ml rich media à une DO 600 de 1,0, puis de graines en deux cultures de 1 litre d'un milieu de levure minime (0,17% de base azotée de levure sans sulfate d'ammonium ou des acides aminés, le sulfate d'ammonium 0,5%) contenant un gamme complète d'acides aminés, complétées par des 20mg / L de l'arginine isotopiquement normale ou lourde (13 C 6 15 N 4; Isotec) et la lysine (13 C 6 15 N 2; Isotec).
- Les cellules ont été cultivées pendant 18 heures, à une DO 600 de 1,8. Il est essentiel que les cellules passent par au moins 9 générations pour atteindre la pleine intégration des isotopes marqués. L'échantillon a été la lumière granulés, lavé à l'eau stérile, réensemencées dans un milieu contenant oléate (isotopiquement normale arginine et la lysine, oléate de 0,2% (Sigma Chemicals) et 0,5% de Tween 40 (Sigma Chemicals)) et stimulés pour un autre 85 minutes. Cela donne une isotopiquement léger, à l'égard de l'arginine et la lysine, oléate-stimulé l'échantillon et un échantillon de référence isotopiquement lourds glucose-cultivés.
Lyse cellulaire, l'isolement et le fractionnement des peptides
- Peser bouteille de centrifugeuse. Récolte des échantillons par centrifugation pendant 3 minutes. Retirez le support et aspirer le liquide en excès. Peser granulés et bouteille (typiquement de rendement entre 1-2 grammes) de geler éclair, puis dans l'azote liquide. Ajouter un volume équivalent au poids de granules de "rectification" tampon pour les boulettes congelées dans l'azote liquide (tampon phosphate salin (PBS, Gibco), 10% de glycérol, inhibiteurs de protéase (comprimés SigmaFAST inhibiteur de protéase, Sigma) et d'inhibiteurs de phosphatase HALT (Thermo Scientific )).
- Gel du récipient de broyage dans l'azote liquide. Attendez que l'azote liquide cesse d'ébullition. Transfert du culot à la cuve de broyage, avec roulements à billes gelées.
- Grind à 600 rpm avec un cycle de 1 min 20 sec avec une inversion de sens pendant 3 minutes. Recongeler le récipient de broyage dans l'azote liquide. Répétez 4 fois plus de 15 minutes au total du temps de broyage.
- Recueillir les grindate congelé dans une glace 50ml Falcon placer le tube sec. Conserver à -80 ° C jusqu'au moment de servir.
- Faire une solution de 10ml de l'urée 8M, bicarbonate d'ammonium 0,1 M, Tris 0,1 M pH 8,6. Ajouter 3 volumes du tampon urée pour 1 volume de grindate congelés (pour 3mls exemple du tampon urée ajoutée à une boulette de 1 gramme par 1 ml de tampon PBS). Immédiatement soniquer le mélange avec un sonicateur pointe de la sonde (2 - 10 impulsions seconde). Garder la pointe près du fond du tube pour empêcher le moussage de la solution. Le grindate doit immédiatement passer en solution.
- Effacer le lysat par centrifugation pendant 5 minutes à 4 ° C.
- Transférer le surnageant dans des tubes frais.
- Faites une partie aliquote de 0,5 M tris [2-carboxyéthyl] phosphine (PTCE). Ajouter à l'échantillon à 1:100 pour une concentration 5 mM finale. Incuber à 37 ° C pendant 1 h.
- Alkylation des cystéines réduites. Laisser refroidir à température ambiante. Faites une partie aliquote de iodoacétamide 1M. Gardez à l'obscurité (nous envelopper le tube dans une feuille). Ajouter à une concentration finale de 20 mM. Incuber dans l'obscurité pendant 1 h à température ambiante.
- Étancher la iodoacétamide 20 mM avec la TNT à partir d'un stock de 1M à température ambiante pendant 1 h.
- Quantifier les protéines avec un standard ou Bradford dosage BCA (non décrit). Prélevez un échantillon pour analyse par SDS-PAGE ci-dessous.
- Pour valider l'incorporation des isotopes lourds, utilisez de 100 ul de lysat réduite et alkylée. Diluer 1:4 avec dH 2 O, soniquer et ajouter la trypsine à 50:1 protéines à la trypsine. Digest pour un minimum de 4 heures, l'échantillon sec dans une speed vac puis dessaler avec une colonne C18 Ultramicrospin (Le groupe Nest).
- Hydratez colonne avec 100 ul d'acétonitrile
- S'équilibrer avec 200 ul 0,1% de TFA.
- Resuspendre échantillon sec dans 200 ul 0,1% de TFA. Charge sur la colonne. Centrifuger à 200 xg ~ ou la vitesse minimale requise pour circuler à travers la colonne.
- Laver deux fois avec 200 ul 0,1% de TFA.
- Éluer avec deux fois avec 50 ul acétonitrile 60%, 0,1% de TFA.
- L'échantillon sec dans un speed vac.
- Remettre en suspension dans l'échantillon 20 ul d'acide formique 0,1%. Run 2 pl sur un spectromètre de masse. Vérifiez l'incorporation de l'arginine et la lysine isotopiquement lourds par un décalage de 10 et 8 Dalton dans le respectifs m / z spectres. L'incorporation de chaque acide aminé doit être entre 96 - 98%.
- Mélanger des quantités équivalentes (mg de protéines) des échantillons isotopiquement lourds et légers.
- Diluer l'échantillon avec du méthanol 01:04 20%.
- Ajouter la trypsine à 1:200. Incuber une nuit à 37 ° C.
- Vérifiez que la digestion est allé à son terme par SDS-PAGE. Run 2 et 4 pl de l'échantillon prédigestion et 8 uneD 16 ul du produit de digestion après la trypsine. Visualisez par coloration au bleu de Coomassie que la digestion est terminée. Si elle n'est pas complète, soniquer l'échantillon avec une pointe de sonde brièvement sonicateur et digérer à nouveau à la trypsine.
- Sécher l'échantillon dans une vitesse ACC. Lorsque ajouter à sec 200 pl de filtrer dH 2 O et le vortex jusqu'à la pastille passe en solution. L'échantillon à sec dans une vitesse ACC. Resuspendre nouveau avec dH 2 O. Sec de l'échantillon à nouveau.
- Resuspendre le culot dans l'acide trifluoroacétique à 0,1% (TFA; Sigma). Vérifier que le pH se situe autour de 3 utilisant des bandes de pH. Si nécessaire acidifier avec TFA 10%.
- Pellet hors tout précipité.
- Dessaler les échantillons sur un Waters Sep-Pak Vac 500 mg colonne C18. Ne surchargez pas ces colonnes. Le montant maximum est de 5 mg, mais il est préférable de charger un peu moins. Divisez l'échantillon entre plusieurs colonnes si nécessaire.
- Hydrater la colonne avec 5 ml d'acétonitrile 100%. Centrifuger à 200 xg ~ ou la vitesse minimale requise pour circuler à travers la colonne.
- Equilibrer la colonne avec du TFA 0,1% 5ml. Charge de l'échantillon. Recueillir des flux et charger à nouveau.
- Laver avec 5 ml de TFA 0,1%. Répéter.
- Éluer avec 2ml 60% d'acétonitrile, 0,1% de TFA.
- L'échantillon à sec dans une vitesse ACC.
Fractionnement de peptides et d'isolement de phosphopeptides
- Les peptides sont fractionnés sur une colonne HILIC. Nous utilisons un TOSOH TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm colonne analytique avec une colonne de garde. Prenez votre temps avec cette étape, exécutez la colonne pendant 2 heures à 90% A deux puis exécutez gradients vierge avant le chargement de votre échantillon. La charge maximale sur une colonne de cette taille est estimée à environ XX, nous typiquement ne chargez pas plus de 5 mg par courir.
- Solvant A - 98% ACN/0.1% de TFA
Solvant B - 2% ACN/0.1% de TFA
Charge à 90% A plus de 20 ', 90% A 85% A plus de 5', 85% A 60% A plus de 40 ', 60% de A à 0% A plus de 5', 0% A% à 90 A sur 5 '. - Le débit est 1mL/min et les fractions ont été collectées à intervalles minutes 2 à partir de 85% A% à 60 Un gradient.
- Combinez les fractions de réduire le nombre de fractions à 10. Fractions accrue donnera probablement une plus grande couverture de l'phosphoprotéome.
Enrichissement de phosphopeptides
- Phosphopeptides sont enrichis en utilisant PHOS-Select gel d'affinité de fer. Nous aliquote de notre résine IMAC pour éviter le gel répétées décongélation. Faire 50 ml d'acide acétique 250 mM, solution à 30% la charge d'ACN. Amener le pH à 2,7 avec HCl. Resuspendre granulés dans 500 pl de solution de charge. Vérifiez le pH, ajuster avec HCl ou NaOH nécessaire.
- Prélavage 200 pi de perles IMAC dans une colonne appropriée. Nous utilisons des colonnes de centrifugation Molbiotec.
Ajouter 15 ul d'une suspension de 50% (gel de charger la solution) à chaque fraction, et incuber les échantillons pendant 30 'avec la fin de rotation plus fin. Gardez le flux pour l'analyse. - Lavez échantillons 3 fois avec une solution de chargement et une fois avec 500 pl filtrée dH 2 O.
- Peptides Eluer avec 2 - 3 min avec 400 ul de 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) de mémoire tampon. Transférer dans un flacon en verre.
- Acidifier à pH 3 avec 5 ul d'acide formique à 100%, gel rapide dans l'azote liquide, et l'échantillon séché dans une vitesse ACC.
- Phosphopeptides Remettre en suspension dans 200 pl de TFA à 0,1% et C18 nettoyage comme décrit ci-dessus. Sécher les échantillons élues dans un speed vac.
- Resuspendre peptides dans 20 ul d'acide formique 0,1%. Utilisez 2 ul par l'analyse du spectromètre de masse ou au besoin.
Remarques
Pour une grande partie de ce protocole vous allez travailler «en aveugle». La lyse cellulaire peut être surveillé par Western Blot et des dosages de Bradford ou BCA, et la digestion par la trypsine peut également être facilement évaluée. La colonne HILIC sera donné une trace semblable à celui-ci, ou comme on le voit par d'autres [1, 2] en fonction de la machine de chromatographie liquide qui est utilisé. Les échantillons sont contrôlés par spectrométrie de masse; tester vos échantillons sur des machines peu coûteuses telles que LCQs ou MALDIs avant d'aller à l'analyse coût élevé sur une haute précision de la masse, une machine à haute résolution. Enfin, si vous assèchement d'un échantillon avec de l'acide qu'il contient, utiliser du verre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cette méthode donnera un enrichissement de phosphopeptides qui peuvent être analysées quantitativement. Un certain nombre de paramètres peuvent être modifiés dans ce protocole, mais l'aspect le plus important à retenir est de préserver votre phosphorylation. Préparation des cellules pour la quantification peut être réalisé dans un certain nombre de manières différentes, par exemple, si vous ne pouvez pas l'étiquette de vos cellules in vivo, des étiquettes telles que l'ICAT [3] ou ITRAC [4] peut être utilisé après l'extraction de façon différentielle l'étiquette deux cultures pour la quantification fins.
Pour le fractionnement des méthodes les plus courantes sont le fractionnement de gel en SDS-PAGE [5, 6], SCX chromatographie [7], et HILIC chromatographie fondée [1, 2]. Nous avons choisi HILIC car il conserve les peptides jusqu'à la fin de la pente, plutôt élution à l'avant de la pente comme dans SCX mais d'autres groupes ont eu de bons résultats avec d'autres méthodes.
Lorsque vous utilisez l'IMAC, vous pouvez avoir besoin d'augmenter ou de diminuer la quantité de résine utilisée, le temps d'incubation ou le nombre de lavages. Il ya également eu des études portant sur la modification de la chimie initiale de la solution de charge que nous présentons ici [8]. Cette combinaison de méthodes doit permettre l'isolement des échantillons qui sont entre 60% à 95% phosphopeptides. Une fois que vous avez établi une méthode pour votre système, vous devriez être en mesure d'optimiser pour un meilleur rendement de phosphopeptides.
Enrichissement de phosphopeptides peuvent également être obtenus avec TiO 2 [9, 10] ou la chimie phosphoramidite [11, 12], et des études ont indiqué que chaque méthode donnera chevauchent encore parties distinctes de l'phosphoprotéome [13].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Rich Rogers pour l'assistance technique avec des analyses par spectrométrie de masse et des discussions utiles, et les Drs. Rob-Moritz, Jeff Ranish, et Hamid Mirzai des discussions utiles.
Ce travail a été financé par le NIH Centres d'excellence.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | |
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | |
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | |
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78420 | |
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | |
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | |
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | |
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | |
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | Tosoh Corp. | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | Tosoh Corp. | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
- Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
- McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
- Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
- Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
- Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
- Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
- Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
- Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
- Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
