Biology

و في المختبر غزو الورم FluoroBlok الفحص

Published: July 20, 2009 doi: 10.3791/1475

Summary

هذا الفيديو يوضح كيفية قياس غزو الخلية من خلال إدراج ثقافة الخلية باستخدام منهجية مضان مقرا لها.

Abstract

السمة المميزة للخلايا النقيلي هو قدرتها على غزو عن طريق الغشاء القاعدي وتهاجر إلى أجزاء أخرى من الجسم. يجب أن تكون قادرة على الخلايا كلا البروتياز التي تفرز كسر الغشاء القاعدي وكذلك الهجرة من أجل أن تكون الغازية. دينار بحريني غزو الورم BioCoat يوفر نظام الخلايا مع الظروف التي تسمح بتقييم ممتلكاتها الغازية

Protocol

بعد وضع العلامات والقياس باستخدام دينار بحريني صبغ نيون calcein AM

وصفت خلايا الكميات بعد أن يكونوا قد غزا من خلال مصفوفة Matrigel دينار بحريني ، ومرت عبر الغشاء FluoroBlok دينار بحريني. ونتيجة لذلك ، يمكن الحصول على القياس فقط نقطة النهاية لغزو الخلايا.

تنمو الخلايا لالتقاء ~ 80 ٪.
إعداد وترطيب نظام إدراج.
1. إزالة الحزمة من تخزين -20 درجة مئوية وتسمح له أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة.
2. فتح الحزمة احباط وإضافة 500 ميكرولتر دافئة (37 درجة مئوية) وسائل الإعلام إلى داخل الآبار إدراج. تسمح لوحة لترطيب لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO _2.
  ملاحظة : إنه ليس من الضروري ترطيب وغير المصقول دينار بحريني فالكون FluoroBlok 24 - Multiwell إدراج النظام الذي سيتم استخدامه في خلية مراقبة الهجرة.
3. بعد الجفاف ، وإزالة بعناية المتوسطة من الآبار من دون إزعاج إدراج طبقة دينار بحريني Matrigel مصفوفة على الغشاء. هذا النظام هو الآن جاهز للاستخدام.
إعداد تعليق خلية trypsinizing monolayers الخلية وإعادة التعليق في مصل الخلايا خالية DMEM في الخلايا 5 × ⁴ 10 / مل.
ملاحظة : إذا كنت تستخدم نوع من الخلايا المختلفة تحتاج إلى تحديد كثافة بذر الأمثل. لتحديد كثافة الغرس الأمثل لنوع من الخلايا الخاصة بك على سطح النمو التي يسهل اختراقها ، واستخدام مجموعة من كثافة بذر (خلية / سم ²⁾ التي بين قوسين كثافة البذر المستخدمة على أسطح غير مسامية (أي القوارير ، وأطباق وصحون). على سبيل المثال ، إذا كنت البذور في الوقت الراهن 2.5 × ⁵ 10 الخلايا / سم ² ، والبذور بتركيزات مختلفة بين الخلية 5 × 10 ⁴ و 5 × 10 ⁵ خلية / سم ² لتحديد الأمثل كثافة بذر الأولي.
إضافة 500 ميكرولتر من التعليق الخلية (2.5 × 10 ⁴ خلايا) إلى غرف القمي.
إضافة 750 ميكرولتر من جاذب كيميائي (5 ٪ في DMEM FBS) في كل دائرة من الدوائر القاعدية ، وذلك باستخدام عينة من أجل الوصول إلى الموانئ.
احتضان للورم BioCoat دينار بحريني نظام الغزو وغير المصقول دينار بحريني فالكون FluoroBlok 24 - Multiwell إدراج خماسي لل20-22 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
التالية الحضانة ، وإزالة بعناية المتوسطة من غرف القمي. ويمكن تحقيق ذلك من خلال محتويات عبها في حاوية النفايات. لا تلمس السطح السفلي من نظام إدراج.
نقل إدراج النظام في لوحة 24 ثانية تحتوي على 500 جيدا ميكرولتر / بئر 4 ميكروغرام / مل في HBSS Calcein AM. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2. لم تتم إزالة الحل AM Calcein من مجلس النواب قبل قراءة مضان لأنها صبغة nonfluorescent الحيوية التي يتم تحويلها إلى calcein الفلورية الخضراء esterases عصاري خلوي.
قراءة مضان من الخلايا في غزت موجات 494/517 نانومتر (م ت / م) على القارئ قراءة لوحة أسفل الفلورسنت. قد كسب الإعداد يجب أن يتم تحديد تجريبيا ، ولكن كسب نقطة الوسط ينبغي أن يكون نقطة انطلاق كافية. ويجوز للحصول على الإعداد التي هي مرتفعة جدا تؤدي إلى تشبع كاشف مع عينة الفلورسنت عالية ، وهذا قد تحول دون اقتناء نتائج مجدية. ليس من المستحسن استخدام autogain (إذا كان معتمدا على القارئ). ويمكن استخدام مجهر مضان مقلوب للتحقق من النتائج ، بل هي مفيدة بشكل خاص للقيام بذلك المرة الأولى التي تقوم بتشغيل هذا الاختبار.
ملاحظة : ومن الأهمية بمكان أن تتم قراءة نظم إدراج باستخدام الخريطة لوحة الصحيح. للحصول على معلومات حول الخرائط لوحة التحميل انظر دينار بحريني الفنية رقم 436 في نشرة www.bdbiosciences.com أو الاتصال بالدعم الفني دينار بحريني (labware@bd.com). التوجه الصحيح هو مع لوحة A1 جيدا في الزاوية اليسرى العليا وشعار القنينة دينار موجهة إلى اليمين كما هو إدراج لوحة الى القارئ.

بيانات لحد

وأعرب عن البيانات كما في المعادلة التالية :

قد يكون طرح خلفية مسبقة على حساب لغزو الخلايا في المئة
RFU الوحدات = الفلورسنت النسبية.

Disclosures

الكتاب والعاملين في العلوم البيولوجية دينار بحريني التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD BioCoat Tumor Invasion System	BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control	BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye	BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling	BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities	PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).
An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. , 6,740,501,B2 (2004).
Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).
Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).