Summary
이 비디오는 형광 기반의 방법론을 사용하여 세포 배양 삽입을 통해 세포의 공격을 측정하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
전이성 세포의 특징은 지하 세포막을 통해 공격해서 신체의 다른 부분으로 마이 그 레이션하는 그들의 능력입니다. 세포가 침입하기 위해 지하 막 내려 휴식뿐만 아니라 마이 그 레이션 모두 분비 프로 테아제 수 있어야합니다. BD BioCoat 종양의 침략 시스템은 자신의 침략적 속성의 평가를 허용 조건과 세포를 제공합니다
Protocol
BD calcein을 사용하는 포스트 - 라벨링 및 측정은 형광 염료 AM
그들은 BD Matrigel 매트릭스를 통해 침략과 BD FluoroBlok 막 통과 후 세포 quantitation에 대해 표시됩니다. 그 결과, 세포 침공만이 종점 측정 얻을 수 있습니다.
- ~ 80 %의 합류에 세포를 성장.
- 준비 및 삽입 시스템을 rehydrate.
- -20 ° C 저장에서 패키지를 제거하고 실온에 와서 수 있습니다.
- 호일 패키지를 열고 삽입 우물의 내부 500 μL 따뜻한 (37 ° C) 미디어를 추가할 수 있습니다. 접시, 37에서 2 시간 동안 rehydrate 허용 ° C 5 % CO 2.
참고 :이 uncoated BD 팰컨 FluoroBlok 셀 마이 그 레이션 컨트롤로 사용됩니다 24 Multiwell 삽입 시스템을 rehydrate 필요는 없습니다. - rehydration 후, 조심스럽게 멤브레인에 BD Matrigel 매트릭스의 계층을 방해하지 않고 삽입 우물에서 매체를 제거합니다. 시스템은 이제 사용할 준비가되었습니다.
- 세포 monolayers을 trypsinizing 5 X 10 4 셀 / ML에서 혈청없는 DMEM에있는 세포를 resuspending하여 셀 suspensions를 준비합니다.
참고 : 다른 세포 유형을 사용하는 경우 최적의 시딩 밀도를 결정하기 위해 필요합니다. 다공성 성장 표면에 세포 유형에 대한 최적의 시딩 밀도를 확인하려면, 시딩 밀도의 범위 (셀 / cm 2) 사용하는 브라켓 비유 공성 표면에 사용되는 시딩 밀도 (즉, flasks, 요리 접시). 예를 들어, 사이의 다양한 세포 농도에서 2.5 X 10 5 세포 / cm 2, 씨앗에서 현재 종자 5 X 10 4 5 X 10 5 세포 / cm 2 최적의 초기 시딩 밀도를 결정합니다. - 혀끝의 방으로 세포 현탁액 500 μL (2.5 X 10 4 세포)를 추가합니다.
- 액세스 샘플 포트를 사용하여 기저 방으로 각 chemoattractant의 750 μL (DMEM에 5% FBS)을 추가합니다.
- BD의 BioCoat 종양의 침략 시스템 및 uncoated BD 팰컨 FluoroBlok 37 ° C, 5 % CO 2 분위기에서 20~22시간 24 - Multiwell 삽입 플레이트를 품어.
- 부화 후, 신중하게 혀끝의 실에서 매체를 제거합니다. 이것은 폐기물 컨테이너에 내용을 flicking하여 수행할 수 있습니다. 삽입 시스템의 바닥 표면을 만지지 마십시오.
- 500 μL / 음 4 μg / ML Calcein HBSS에서 AM을 포함한 초 24 - 잘 접시에 삽입 시스템을 전송합니다. 37에서 1 시간 동안 품어 ° C 5 % CO 2. 그것이 cytosolic esterases로 녹색 형광 calcein로 변환됩니다 nonfluorescent 중요한 염료이기 때문에 Calcein AM 솔루션은 형광을 읽기 전에 하부 챔버에서 제거되지 않습니다.
- 침입 세포의 형광은 하단 읽기 형광 플레이트 리더에 517분의 494 NM (예 / 엠)의 파장에서 읽습니다. 게인 설정은 경험적으로 결정 할 수도 있지만, 미드 이득이 충분 출발점되어야합니다. 너무 높은 이득 설정은 높은 형광 시료와 검출기의 포화로 이어질 수 있으며, 이것은 의미있는 결과의 인수를 방지할 수 있습니다. autogain의 사용 (귀하의 리더에서 지원하는 경우)하지 않는 것이 좋습니다. 거꾸로 형광 현미경은 결과를 확인하는 데 사용할 수 있으며이에게이 분석을 실행 처음 할 특히 유용합니다.
참고 : 그것은 삽입 시스템이 올바른 플레이트지도를 사용하여 읽는 것이 가장 중요합니다. 로딩 플레이트지도에 대한 자세한 내용은 www.bdbiosciences.com 또는 문의 BD 기술 지원 (labware@bd.com)에서 BD 기술 게시판 번호 436을 참조하십시오. 접시가 판독기에 삽입되는 등 적절한 플레이트 방향은 오른쪽으로 방향 왼쪽 상단 모서리와 BD Flacon 로고에 잘 A1이다.
데이터 감소
데이터는 다음과 같은 등식과 같이 표현된다 : 
배경 %의 세포 침공의 계산하기 전에 빼서 수 있습니다
RFU = 상대 형광 단위.
Disclosures
저자는이 문서에서 사용하는 시약 및 도구를 만들어 BD Biosciences의 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD BioCoat Tumor Invasion System | BD Biosciences | 354165 or 354166 | |
| HT-1080 and NIH/3T3 cells | ATCC | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free) | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS) | |||
| BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control | BD Biosciences | 351157 or 351158 | |
| 5% Fetal Bovine Serum in DMEM | |||
| BD Calcein AM Fluorescent Dye | BD Biosciences | 354216 or 354217 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | |||
| BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling | BD Biosciences | 351147 | |
| Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities | PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar. |
References
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