Biology

במבחנה Invasion FluoroBlok גידול Assay

Published: July 20, 2009 doi: 10.3791/1475

Summary

וידאו זה מדגים כיצד למדוד את הפלישה תא דרך התרבות מוסיף התא באמצעות מתודולוגיה מבוססת הקרינה.

Abstract

סימן ההיכר של תאים גרורתי הוא היכולת שלהם לחדור דרך הממברנה המרתף לעבור לחלקים אחרים של הגוף. תאים צריכים להיות מסוגלים גם להפריש פרוטאזות כי לשבור את קרום מרתף וכן להעביר כדי להיות פולשני. BD הפלישה BioCoat המערכת מספקת גידול התאים בתנאים המאפשרים הערכה של הרכוש שלהם פולשנית

Protocol

פוסט תיוג ומדידה באמצעות BD calcein AM צבע פלואורסצנטי

תאים מסומנים עבור quantitation לאחר שהם פלשו דרך Matrigel BD מטריקס עברה דרך הממברנה BD FluoroBlok. כתוצאה מכך, רק מדידת נקודת הסיום של הפלישה תא ניתן לקבל.

לגדל תאים מפגש ~ 80%.
הכן את רעננותם ואת המערכת להוסיף.
1. הסר את החבילה אחסון -20 ° C ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.
2. פתח את החבילה בנייר ולהוסיף 500 μL חמים (37 מעלות צלזיוס) התקשורת הפנים של בארות להוסיף. אפשר צלחת כדי רעננותם עבור 2 שעות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
  הערה: אין צורך רעננותם ציפוי BD פלקון FluoroBlok 24-Multiwell מערכת הכנס שישמש כביקורת נדידת תאים.
3. לאחר התייבשות, להסיר בזהירות את המדיום מבארות להוסיף מבלי להפריע את שכבת BD Matrigel מטריקס על הממברנה. המערכת נמצאת כעת מוכן לשימוש.
הכן השעיות התא על ידי trypsinizing monolayers התא resuspending התאים בדם ללא DMEM ב 5 x 10 ⁴ תאים / מ"ל.
הערה: אם אתה משתמש סוג תא אחר אתה צריך לקבוע את צפיפות זריעה אופטימלית. כדי לקבוע את צפיפות זריעה אופטימלית עבור סוג הסלולרי שלך על משטח נקבובי הצמיחה, להשתמש במגוון של צפיפות זריעה (תאים / ס"מ ²⁾ כי הסוגריים צפיפות זריעה בשימוש על משטחים nonporous (כלומר, צלוחיות, צלחות וצלחות). לדוגמה, אם אתה כרגע זרע ב 2.5 x 10 תאים ⁵ / ² ס"מ, זרע בריכוזים תאים שונים בין 5 x 10 x ⁴ ו -5 תאים 10 ⁵ / ² ס"מ, כדי לקבוע את צפיפות אופטימלי זריעת הראשונית.
הוספת 500 μL ההשעיה תא (2.5 x 10 ⁴ תאים) לתאי apical.
הוספת 750 μL של chemoattractant (5% ב FBS DMEM) לכל אחד מתאי הבסיס, באמצעות יציאות מדגם עבור גישה.
דגירה גידול BioCoat BD הפלישה מערכת ציפוי BD פלקון FluoroBlok 24-Multiwell פלייט הכנס עבור 20-22 שעות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באטמוספירה.
לאחר דגירה, להסיר בזהירות בינוני מתאי apical. ניתן להשיג זאת על ידי מצליף את התוכן לתוך מיכל פסולת. אל תיגע במשטח התחתון של המערכת להוסיף.
מעבירים את המערכת להכניס צלחת 24 היטב נוספת שהכילה 500 μL / טוב של 4 מיקרוגרם / מ"ל Calcein AM ב HBSS. דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. הפתרון AM Calcein לא יוסר החדר התחתון לפני קריאת הקרינה כי זה צבע חיוני nonfluorescent כי מומר calcein פלואורסצנטי ירוק על ידי esterases cytosolic.
הקרינה של התאים פלשו קוראים באורכי גל של 494/517 ננומטר (אקס / em) על הקורא התחתונה קריאה צלחת ניאון. הגדרת רווח ייתכן שיהיה צורך נקבע באופן אמפירי, אך רווח האמצע צריך להיות נקודת התחלה מספיק. הגדרה רווח זה גבוה מדי עלול להוביל הרוויה של הגלאי עם מדגם ניאון מאוד, זה עשוי למנוע את הרכישה של תוצאות משמעותיות. השימוש autogain (אם נתמך על הקורא שלך) אינה מומלצת. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה ניתן להשתמש כדי לאמת את התוצאות שלך, זה מועיל במיוחד לעשות את זה בפעם הראשונה שתפעיל את זה assay.
הערה: זה הוא בעל חשיבות עליונה כי מערכות הכנס נקראים באמצעות צלחת המפה הנכונה. למידע על מפות צלחת טעינת לראות BD עלון טכני מס '436 על www.bdbiosciences.com או צרו קשר עם BD תמיכה טכנית (labware@bd.com). אוריינטציה צלחת פרופר הוא עם A1 גם בפינה השמאלית העליונה ואת הלוגו Flacon BD אוריינטציה ימינה כמו צלחת מוכנס לתוך הקורא.

נתוני הפחתת

נתונים מבוטא במשוואה הבאה:

רקע יכול להיות מופחתים לפני החישוב של הפלישה תא אחוזים
RFU = יחידות פלורסנט יחסית.

Disclosures

הכותבים הם עובדי BD Biosciences המייצרת ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD BioCoat Tumor Invasion System	BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control	BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye	BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling	BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities	PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).
An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. , 6,740,501,B2 (2004).
Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).
Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).