Bir In vitro FluoroBlok Tümör Invasion Testi

Published: July 20, 2009 doi: 10.3791/1475

Jeff Partridge¹, Paula Flaherty¹

¹BD Biosciences, Discovery Labware

Summary

Bu video ile hücre işgali bir floresan tabanlı bir metodoloji kullanarak hücre kültürü ekler nasıl ölçüleceğini gösteriyor.

Abstract

Damgasını metastatik hücreler bazal membran ile istila ve vücudun diğer bölgelerine göç etmek yeteneğine sahip olmalarıdır. Hücreler, invaziv olması için bazal membran parçalayan yanı sıra göç hem salgılar proteazlar gerekir. BD BioCoat Tümör Invasion Sistem kendi invaziv mülkiyet değerlendirilmesine olanak koşulları ile hücreleri sağlar.

Protocol

BD Calcein kullanarak Post-etiketleme ve ölçüm Floresan Boya

Hücreler, BD Matrigel Matrix aracılığıyla işgal ve BD FluoroBlok zarından geçtikten sonra kantitatif için etiketlenir. Sonuç olarak, hücre işgalinin sadece uç nokta ölçümü elde edilebilir.

~ 80% izdiham hücrelerin büyümesine.
Hazırlayın ve ekleme sistemi rehidrate.
1. -20 ° C depolama paketi çıkartın ve oda sıcaklığına gelmesine izin.
2. Folyo paketi açın ve ekleme kuyu iç 500 mcL sıcak (37 ° C) medya ekleyin. İzin plaka 37 az 2 saat rehidrate ° C, 5% CO _2.
  Not: kaplanmamış BD Falcon FluoroBlok bir hücre göçü kontrol olarak kullanılan 24-multiwell Ekle Sistemi rehidrate için gerekli değildir.
3. Rehidrasyon sonra, membran BD Matrigel Matrix katmanı bozmadan özenle ekleme kuyulardan orta kaldırmak. Sistemi artık kullanıma hazırdır.
Hücre mono tabakaları trypsinizing ve 5 x 10 ⁴ hücre / ml serum serbest DMEM hücreleri resuspending hücre süspansiyonları hazırlayın.
Not: Eğer farklı bir hücre tipi kullanıyorsanız, en uygun ekim yoğunluğu belirlemek gerekir. , Gözenekli bir büyüme yüzey üzerinde hücre tipi için en uygun ekim yoğunluğu belirlemek için bir dizi ekim yoğunlukları (hücre / cm ²⁾ parantez gözeneksiz yüzeylerde kullanılan tohum yoğunluğu (yani matara, yemekler ve plakalar) . Örneğin, çeşitli hücre konsantrasyonlarda arasında 2.5 x 10 ⁵ hücre / cm ^2, tohum henüz tohum 5 x 10 ⁴ ve 5 x 10 ⁵ hücre / cm ² optimal ilk tohumlama yoğunluğunu belirlemek için.
Apikal odalarına hücre süspansiyonu (2.5 x 10 ⁴ hücre) 500 mcL ekleyin.
Erişim için örnek bağlantı noktalarını kullanarak, bazal odalarının her biri 750 mcL kemoatraktan (DMEM içinde% 5 FBS) ekleyin.
BD BioCoat Tümör Invasion Sistemi ve kaplanmamış BD Falcon FluoroBlok, 37 ° C'de% 5 _CO 2 atmosfer 20-22 saat süreyle 24-multiwell Ekle Plaka inkübe edin .
Inkübasyon sonrasında dikkatle apikal odalarından orta çıkarın. Bu, bir atık kabı içine içeriğini Flicking tarafından yapılabilir. Ekleme sistemi alt yüzeyine dokunmayın.
/ Iyi 4 mikrogram / ml Calcein PM HBSS içinde 500 mcL içeren ikinci bir 24 plaka ekleme sistemi aktarın. 1 saat 37 ° ° C'de,% 5 CO _2. Sitozolik esterazlar yeşil flüoresan Calcein dönüştürülür nonfluorescent hayati boya çünkü Calcein AM çözüm floresan okumadan önce alt kamara kaldırılmaz.
Işgal hücreleri Floresans bir alt okuma floresan plak okuyucu (Ex / Em) 494/517 nm dalga boylarında okunur. Kazanç ayarı ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir, ancak bir orta nokta kazancı yeterli bir başlangıç noktası olmalıdır. Çok yüksek bir kazanç ayarı yüksek floresan örneği ile dedektör doygunluk yol açabilir, bu anlamlı sonuçlar elde önleyebilir. Autogain (okuyucu desteklenmesi halinde) kullanımı tavsiye edilmez. Ters bir floresan mikroskop sonuçları doğrulamak için kullanılabilir; bu testte ilk kez çalıştırdığınızda yapmak için özellikle yararlı.
Not: Ekle Sistemleri doğru plaka haritası kullanılarak okunur olduğunu büyük önem taşımaktadır. Www.bdbiosciences.com veya iletişim BD Teknik Destek (labware@bd.com) BD Teknik Bülten No 436 yükleme plakası haritalar hakkında daha fazla bilgi için bkz. Plaka okuyucu eklenir Uygun plaka yönü sağa yönelik sol üst köşesinde ve BD Flakon logosu A1 kuyusunda.

Veri İndirgeme

Veri aşağıdaki denklemle ifade edilir:
Denklem
Arka Plan hesaplama yüzde hücre işgali öncesinde çıkarılmalıdır
RFU = göreceli floresan birimleri.

Disclosures

Yazarlar bu makalede kullanılan reaktifler ve araçları üreten BD Biosciences çalışanları.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD BioCoat Tumor Invasion System	BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control	BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye	BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling	BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities	PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).
An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. , 6,740,501,B2 (2004).
Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).
Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).