Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En In vitro FluoroBlok tumör Invasion analys

Published: July 20, 2009 doi: 10.3791/1475

Summary

Denna video visar hur man kan mäta cell invasion genom insatser cellodling med hjälp av en fluorescens-baserad metod.

Abstract

Det kännetecknande för metastaserande celler är deras förmåga att invadera igenom basalmembranet och migrera till andra delar av kroppen. Cellerna måste kunna både utsöndra proteaser som bryter ner basalmembranet samt migrera för att vara invasiva. BD BioCoat tumör Invasion System ger celler med villkor som möjliggör bedömning av deras invasiva egendom

Protocol

Post-märkning och mätning med hjälp av BD kalcein AM fluorescerande färg

Celler är märkta för kvantifiering efter att de har invaderat genom BD Matrigel Matrix och passerade genom BD FluoroBlok membranet. Som ett resultat kan endast resultatmåttsmätningen av cell invasion erhållas.

  1. Grow celler till ~ 80% sammanflödet.
  2. Förbered och återfuktar insatsen systemet.
    1. Ta bort förpackningen från -20 ° C lagring och låt den komma till rumstemperatur.
    2. Öppna folieförpackningen och lägga till 500 mikroliter varmt (37 ° C) media till det inre av insatsen brunnar. Låt plattan rehydrera i 2 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2.
      OBS: Det är inte nödvändigt att rehydrera obestruket BD Falcon FluoroBlok 24-multispot Sätt System som kommer att användas som en cell migration kontroll.
    3. Efter rehydrering, försiktigt bort mediet från insatsen brunnar utan att störa lagret av BD Matrigel Matrix på membranet. Systemet är nu redo att använda.
  3. Förbered cellsuspensioner av trypsinizing cell monolager och resuspending cellerna i serumfritt DMEM på 5 x 10 4 celler / ml.
    Anm: Om du använder en annan celltyp du behöver för att fastställa den optimala sådd densitet. Att fastställa den optimala sådd densitet för din celltyp på en porös tillväxt yta, använd en rad seedning densitet (celler / cm 2) som parentes sådd densitet som används på nonporous ytor (dvs flaskor, fat och tallrikar). Till exempel, om du för närvarande utsädet på 2,5 x 10 5 celler / cm 2, utsäde vid olika cell-halter mellan 5 x 10 4 och 5 x 10 5 celler / cm 2 för att bestämma den optimala första sådd densitet.
  4. Tillsätt 500 mikroliter cellsuspension (2,5 x 10 4 celler) till apikala kamrarna.
  5. Tillsätt 750 mikroliter av chemoattractant (5% FBS i DMEM) till envar av de basala kamrarna, med hjälp av prov portar för åtkomst.
  6. Inkubera BD BioCoat System tumör Invasion och obestruket BD Falcon FluoroBlok 24-multispot Sätt tavla i 20-22 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2 atmosfär.
  7. Efter inkubation, försiktigt bort mediet från den apikala kamrarna. Detta kan uppnås genom att ställa innehållet i en avfallsbehållare. Rör inte bottenytan av insatsen systemet.
  8. Överför in systemet i en andra 24-brunnar innehåller 500 mikroliter / brunn av 4 mikrogram / ml kalcein AM i HBSS. Inkubera 1 timme vid 37 ° C, 5% CO 2. Den kalcein AM Lösningen är inte bort från den nedre kammaren innan du läser fluorescens eftersom det är en nonfluorescent viktigt färgämne som omvandlas till grönt fluorescerande kalcein av cytosoliska esteraser.
  9. Fluorescens invaderade celler läses vid våglängderna 494/517 nm (Ex / Em) på en botten behandlingen fluorescerande plattläsaren. Vinsten inställning kan behöva bestämmas empiriskt, men en mittpunkt vinst bör vara ett tillräckligt utgångspunkt. En vinst inställning som är för hög kan leda till mättnad av detektorn med mycket fluorescerande provet, detta kan förhindra förvärv av meningsfulla resultat. Användning av AutoGain (om det stöds av din läsare) rekommenderas inte. Ett inverterat fluorescensmikroskop kan användas för att verifiera dina resultat, det är framförallt bra att göra detta första gången du kör denna analys.
    OBS: Det är av yttersta vikt att Infoga Systems läses med rätt platta kartan. För information om hur du fyller tallriken kartor se BD Teknisk Bulletin No 436 på www.bdbiosciences.com eller kontakta BD teknisk support (labware@bd.com). Rätt platta inriktning är med väl A1 i övre vänstra hörnet och BD flacon logotyp orienterade åt höger plattan sätts in i läsaren.

Datareduktion

Data är uttryckt i följande ekvation:
Ekvation
Bakgrund kan dras av före beräkningen av procent cell invasion
RFU = relativt fluorescerande enheter.

Disclosures

Författarna är anställda av BD Biosciences som producerar reagenser och verktyg som används i denna artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD BioCoat Tumor Invasion System BD Biosciences 354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control BD Biosciences 351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye BD Biosciences 354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling BD Biosciences 351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
  2. Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
  3. Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
  4. Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
  5. Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).
  6. An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. , 6,740,501,B2 (2004).
  7. Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
  8. Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).
  9. Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).

Tags

Cellbiologi tumör Invasion Assay kemotaxi kalcein-AM Matrigel Falcon Fluoroblok migration Invasion tumör BD Matrigel Boyden kammare rörlighet Haptotaxis
En<em> In vitro</em> FluoroBlok tumör Invasion analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Partridge, J., Flaherty, P. AnMore

Partridge, J., Flaherty, P. An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay. J. Vis. Exp. (29), e1475, doi:10.3791/1475 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter